คลังข้อมูลการวิจัยการเกษตรไทย

สืบค้นงานวิจัย

โครงการวิจัยการศึกษาความหลากหลายและการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ

กรมวิชาการเกษตร - กรมวิชาการเกษตร

ชื่อเรื่อง:	โครงการวิจัยการศึกษาความหลากหลายและการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ
ชื่อเรื่อง (EN):	Application of Biotechnology for Genetic Diversity and Breeding in Cassava
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ:	กรมวิชาการเกษตร
ผู้ร่วมงาน / ผู้ร่วมวิจัย:	บุญเรือนรัตน์ เรืองวิเศษ บุญเรือนรัตน์ เรืองวิเศษ
คำสำคัญ:	มันสำปะหลัง การฉายรังสี การปรับปรุงพันธุ์ แบคทีเรียลไบลท์ การผลิตน้ำตาล การผลิตโปรตีน การผลิตไซยาไนต์ การโคลนยีน การสังเคราะห์โปรตีน เห็ด เอนไซม์เซลลูเลส การถ่ายยีน การผลิตเอทานอล เชื้อรา แบคทีเรีย ยีสต์ ชีวสารสนเทศศาสตร์ บาซิลลัส ซับทิลิส เอนไซม์ อะไมเลส ยีนเปอร์ออกซิเดส
คำสำคัญ (EN):	Xam
บทคัดย่อ:	มันสำปะหลังเป็นพืชส่งออกที่สำคัญและมีบทบาทสำคัญเพิ่มขึ้นเพราะเป็นพืชพลังงานเป็นวัตถุดิบในการผลิตเอทานอลจากแป้งจึงเป็นพืชที่มีความต้องการสูงมากในปัจจุบัน ในการผลิตมันสำปะหลังของเกษตรกรโดยทั่วไปยังใช้เทคนิคดั้งเดิม ประกอบกับพื้นที่ในการผลิตเสื่อมโทรมลง การนำเทคโนโลยีชีวภาพมาพัฒนาด้านการปรับปรุงพันธุ์และด้านอื่น ๆ จึงมีความจำเป็น โครงการวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อสร้างความหลากหลายทางพันธุกรรมของมันสำปะหลังโดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ เพื่อศึกษาความหลากหลายของพันธุ์มันสำปะหลังในประเทศไทยโดยใช้เทคนิคชีวโมเลกุล การพัฒนาโมเลกุลเครื่องหมายสำหรับการตรวจสอบลักษณะสำคัญทางเศรษฐกิจ การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะที่สำคัญทางเศรษฐกิจของมันสำปะหลัง การรวบรวม ศึกษา ปรับปรุงสายพันธุ์จุลินทรีย์ที่มีประโยชน์ ด้วยเทคนิคพันธุวิศวกรรม การถ่ายยีนเข้าสู่มันสำปะหลังสำหรับการปรับปรุงพันธุ์และจัดทำระบบชีวสารสนเทศศาสตร์ของมันสำปะหลัง การสร้างพันธุ์มันสำปะหลังเตทราพลอยด์โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ ใช้ตาข้างและตายอดของมันสำปะหลังพันธุ์ระยอง7 ระยอง9 และเกษตรศาสตร์50 อายุ 30-45 วัน ฟอกฆ่าเชื้อที่ผิวเพาะเลี้ยงบน MS medium ผสมซูโครส 20 ก./ลิตร 30-45 วัน ได้ต้นกล้ามันสำปะหลังที่สมบูรณ์ ใช้เป็น explant สำหรับชักนำให้เป็นโพลิพลอยด์ โดยวิธีการเพาะเนื้อเยื่อร่วมกับโคลชิซินเข้มข้น 0.002-0.003% ผสม DMSO 2% explant ที่มีชีวิตรอด จำนวน 33-58% สามารถเจริญและพัฒนาต่อไปเป็นต้นกล้า โพลิพลอยด์มีต้นเตี้ย ข้อถี่ ใบหนา เขียวเข้ม หยักเว้าน้อย การเจริญเติบโตช้า มีรากใหญ่และสั้น การคัดเลือกมันสำปะหลังโพลิพลอยด์ในสภาพปลอดเชื้อโดยวิธีการตัดเป็นข้อๆ ละ 1 ตา ปฏิบัติซ้ำทุก 4-6 ชั่วโมง จะได้ต้นกล้ามันสำปะหลังโพลิพลอยด์ที่ไม่มีลักษณะ Chimera 100% สามารถผลิตต้นมันสำปะหลังที่มีโครโมโซมแบบโพลีพลอยด์ได้ 1 ต้น และเก็บรักษาไว้ที่เรือนเพาะต้นไม้สถาบันวิจัยพืชไร่เพื่อนำไปพัฒนาให้เป็นต้นมันที่สมบูรณ์ต่อไป การศึกษาความหลากหลายของพันธุ์มันสำปะหลังในประเทศไทยโดยใช้เทคนิค SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความหลากหลายของพันธุ์มันสำปะหลังที่สำคัญของไทย 15 สายพันธุ์ ทำการทดสอบ PCR โดยใช้ไพร์เมอร์แบบสุ่ม RAPD ขนาด 10 เบส จำนวน 122 สาย ได้ไพร์เมอร์ 13 สาย ที่สามารถแยกความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์มันสำปะหลัง แล้วคัดเลือกชิ้นดีเอ็นเอเป้าหมายที่ให้ความแตกต่างในแต่ละสายพันธุ์ได้จำนวน 32 แถบ นำมาโคลนเข้าสู่เวคเตอร์เพื่อหาลำดับเบส แล้วออกแบบไพร์เมอร์ที่จำเพาะเจาะจงจากปลาย 5’ ของดีเอ็นเอทั้ง 2 สาย ได้ไพร์เมอร์ SCAR ได้แก่ 4 คู่สาย JDOA45-4, JDOA2, JDOAC3 และ JDOA4 นำมาจำแนกมันสำปะหลัง 15 พันธุ์ พบว่า JDOA2 สามารถจำแนกลักษณะจำเพาะทางจีโนไทป์ของพันธุ์ระยอง 2 ได้ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 986 เบส และคู่ไพร์เมอร์ JDOA4 จำแนกมันสำปะหลังพันธุ์ระยอง 60 และ พันธุ์ห้านาที ได้ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 922 เบส เมื่อนำแถบดีเอ็นเอที่ได้จากไพร์เมอร์ SCAR มาวิเคราะห์หาความสัมพันธ์ทางพันธุกรรมสามารถแบ่งกลุ่มพันธุ์มันสำปะหลังออกเป็น 2 กลุ่มใหญ่ ได้แก่ กลุ่ม 1 ประกอบด้วย พันธุ์ระยอง 1/1, ระยอง 1/2, ระยอง 2, ระยอง 5, CMR 35 และ CMR 36 กลุ่ม 2 ประกอบด้วยพันธุ์ระยอง 3, ระยอง 7, ระยอง 9, ระยอง 60, ระยอง 72, ระยอง 90, เกษตรศาสตร์ 50, ห้วยบง 60 และพันธุ์ห้านาที การศึกษาความแตกต่างทางพันธุกรรมของมันสำปะหลังไทยต้านทานโรคแบคทีเรียลไบลท์โดยใช้ยีนเปอร์ออกซิเดส วัตถุประสงค์ของการทดลองนี้เพื่อนำยีนที่โคลนได้จากการศึกษาก่อนหน้านี้ ได้แก่ ซีเครททอรีเปอร์ออกซิเดส (PX3) และยีนแคทไอออนนิกเปอร์ออกซิเดส (MPER1) มาใช้เป็นยีนโพรบหรือยีนติดตาม ด้วยวิธีการจีโนมิกเซาเทิร์นบลอทไฮบริไดซ์เซชั่น (Genomic southern blot hybridization) และใช้สารปลอดรังสีเป็นสารติดฉลาก (Chemiluninescent) ผลการทดลองให้ผลบวก การทดลองนี้สามารถประยุกต์ใช้หรือนำวิธีการจีโนมิกเซาเทิร์นบลอทมาใช้ในการระบุหายีนในระดับจีโนมต่อไปได้ โรคแบคทีเรียไบลท์หรือโรคใบไหม้ (Cassava Bacterial Blight, CBB) เชื้อสาเหตุคือ Xanthomonas ampestris pv. Manihotis เครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ความแตกต่างระหว่างพันธุ์ต้านทานและอ่อนแอต่อโรคแบคทีเรียลไบลท์ในมันสำปะหลัง การทดลองนี้ได้ตรวจสอบความแตกต่างของดีเอ็นเอระหว่างพันธุ์มันสำปะหลังที่ต้านทาน (1ระยอง 90 2ระยอง 9) และพันธุ์อ่อนแอ (3ระยอง 5) พันธุ์ ต่อโรคแบคทีเรียลไบลท์ ด้วยเครื่องหมายโมเลกุลชนิด microsatellite ที่พัฒนาจากมันสำปะหลัง และ EST-SSR ที่พัฒนาจากยางพารา ผลการทดสอบพบเครื่องหมายโมเลกุลพบไพรเมอร์ที่ให้รูปแบบของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน จำนวน 50 คู่ไพรเมอร์ ได้แก่ SSRY1 SSRY5 SSRY8 SSRY10 SSRY12 SSRY13 SSRY19 SSRY20 SSRY21 SSRY23 SSRY32 SSRY34 SSRY40 SSRY45 SSRY50 SSRY51 SSRY61 SSRY62 SSRY64 SSRY66 SSRY69 SSRY70 SSRY79 SSRY86 SSRY90 SSRY91 SSRY95 SSRY96 SSRY97 SSRY100 SSRY101 SSRY102 SSRY103 SSRY105 SSRY106 SSRY120 SSRY128 SSRY143 SSRY155 SSRY178 SSRY181 emHbDOA63 emHbDOA78 emHbDOA175 emHbDOA177 emHbDOA178 emHbDOA185 emHbDOA187 emHbDOA190 และ emHbDOA196 โดยไพรเมอร์เหล่านี้สามารถนำไปวิเคราะห์หาความเกี่ยวข้องกับลักษณะการต้านทานต่อแบคทีเรียลไบลท์ในมันสำปะหลัง โดยใช้ประชากรที่เกิดจากการผสมระหว่างพันธุ์ต้านทาน และพันธุ์อ่อนแอ เครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ความแตกต่างระหว่างพันธุ์ที่เก็บผลผลิตได้เร็วและช้าในมันสำปะหลัง ได้ค้นหาเครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ความแตกต่างระดับดีเอ็นเอของพันธุ์มันสำปะหลังที่ให้ผลผลิตเร็ว (ระยอง 60) และพันธุ์ที่ให้ผลผลิตช้า (ระยอง 72) โดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลชนิด microsatellite ที่พัฒนาจากมันสำปะหลัง และ EST-SSR ที่พัฒนาจากยางพารา ผลจากการทดลองพบเครื่องหมายโมเลกุลที่ให้ขนาดของแถบดีเอ็นเอที่แตกต่างกัน จำนวน 48 คู่ไพรเมอร์ ได้แก่ SSRY1 SSRY5 SSRY8 SSRY10 SSRY12 SSRY13 SSRY19 SSRY20 SSRY21 SSRY23 SSRY32 SSRY34 SSRY40 SSRY45 SSRY50 SSRY51 SSRY61 SSRY62 SSRY64 SSRY66 SSRY69 SSRY70 SSRY79 SSRY86 SSRY90 SSRY91 SSRY95 SSRY96 SSRY97 SSRY100 SSRY101 SSRY102 SSRY103 SSRY105 SSRY106 SSRY120 SSRY128 SSRY143 SSRY155 SSRY178 SSRY181 emHbDOA63 emHbDOA78 emHbDOA175 emHbDOA177 emHbDOA178 emHbDOA185 emHbDOA187 emHbDOA190 และ emHbDOA196 ซึ่งไพรเมอร์ดังกล่าวนี้เหล่านี้สามารถนำไปใช้วิเคราะห์หาความเกี่ยวข้องกับลักษณะการให้ผลผลิตเร็วในมันสำปะหลัง โดยใช้ประชากรที่เกิดจากการผสมระหว่างพันธุ์ให้ผลผลิตเร็ว กับพันธุ์ที่ให้ผลผลิตช้า การคัดเลือกพันธุ์มันสำปะหลังที่มีปริมาณสารไซยาไนด์ต่ำด้วยวิธีการชีวเคมีและเทคนิคโมเลกุลพบว่าการแสดงออกของยีน cypD1, cypD2 และ linamarase ที่ยอดในต้นอายุ 1 เดือน มีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณไซยาไนด์ที่พบในยอดอายุ 1 เดือน และหัวอายุ 12 เดือน สามารถแสดงความแตกต่างในการผลิตไซยาไนด์ของแต่ละพันธุ์ได้ในขณะที่ยังเป็นต้นอ่อน โดยทำการทดสอบ จากผลการแสดงออกของยีน cypD1, cypD2 และ linamarase ที่ยอดในต้นอายุ 1 เดือน มีความสัมพันธ์โดยตรงกับปริมาณไซยาไนด์ที่ในหัวมันสำปะหลังอายุ 12 เดือน . สามารถใช้การแสดงออกของยีน cypD1 ในใบอ่อนของต้นอายุ 1 เดือน ในการคัดเลือกต้นที่มีไซยาไนด์สูงหรือต่ำได้. ค่า R2 ที่ต่ำเกิดจาก outliner บางตัวอย่างที่ปริมาณไซยาไนด์ไม่สอดคล้องกับการแสดงออกของยีนสาเหตุหลักเกิดจากสภาพแวดล้อมที่ส่งผลต่อกลุ่มประชากรลูกผสมที่ตรวจสอบ การปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังเพื่อแป้งสูงโดยใช้เครื่องหมายโมเลกุลคัดเลือกพันธุ์ I..แผนที่พันธุกรรม การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลเพื่อใช้คัดเลือกพันธุ์มันสำปะหลัง ตั้งแต่ ปี 2549-53 ได้สร้างแผนที่พันธุกรรมมันสำปะหลังจากประชากรลูกผสมชุดที่ 1 ระหว่างพันธุ์ห้านาทีกับห้วยบ่ง 60 และประชากรลูกผสมชุดที่ 2 ระหว่างพันธุ์ห้วยบ่ง 60 กับพันธุ์5นาที แผนที่พันธุกรรมของประชากรลูกผสมชุดที่ 1 ประกอบด้วยเครื่องหมายพันธุ์กรรมทั้งสิ้น 317 เครื่องหมาย บน 29 กลุ่มเครื่องหมาย ครอบคลุม 1,481.42 cM และมีค่าเฉลี่ยระยะระหว่างเครื่องหมาย 6.10 cM ส่วนแผนที่พันธุกรรมลูกผสมชุดที่ 2 นั้นประกอบด้วยเครื่องหมายพันธุกรรมทั้งสิ้น 373 เครื่องหมาย บน 27 กลุ่มเครื่องหมาย ครอบคลุม 1,283.6 cM และมีค่าเฉลี่ระยะระหว่างเครื่องหมาย 6.27 cM แม้ว่าแผนที่พันธุกรรมที่ถูกสร้างขึ้นนั้นจะยังไม่ครอบคลุมทั้งจีโนมมันสำปะหลัง อย่างไรก็ตาม แผนที่ทั้งสองก็ครอบคลุมมากกว่า 80 เปอร์เซ็นต์ของจีโนมและมีค่าเฉลี่ยระยะระหว่างเครื่องหมายน้อยกว่า 10 cM ซึ่งสามารถนำมาใช้ในการวิเคราะห์หาตำแหน่งที่สัมพันธ์กับลักษณะเชิงปริมาณ QTL ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการต้านทานโรคแบคทีเรียลไบลท์ ซึ่งเป็นโรคใบไหม้ของมันสำปะหลัง (Cassava bacterial blight, CBB) มีสาเหตุมาจากเชื้อแบคทีเรีย Xanthomonas ampestris pv. manihotis ในการศึกษาครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อโคลนยีนเปอร์ออกซิเดส (Peroxidases) จาก มันสำปะหลังพันธุ์ระยอง 60 (MTAI 60) ซึ่งเป็นพันธุ์ต้านทานโรคใบไหม้จำนวน 2 ยีน ได้แก่ Cationic peroxidase (MPER1) และ Secretory peroxidase (PX3) ผลการศึกษาพบว่าเหมือนกับลำดับนิวคลิโอไทด์ของ MPER1 (Genbank accession number EF645823) มีขนาด 1,211 นิวคลิโอไทด์ (98 กรดอะมิโน) ประกอบด้วย 2 exons และ 1 intron ส่วนลำดับนิวคลิโอไทด์ของ PX3 (GenBank accession number EF645824) มีขนาด 945 นิวคลิโอไทด์ (134 กรดอะมิโน) ประกอบด้วย 3 exons และ 2 introns ยีนทั้งสองแสดง Conserved domain กับเปอร์ออกซิเดสซูเปอร์แฟมิลียีนในพืชชนิดอื่น ยีนที่ได้จากการศึกษานี้จะเป็นประโยชน์เชิงโมเลกุลเครื่องหมายที่อาจแสดงลักษณะสัมพันธ์กับความต้านทานโรคใบไหม้เพื่อการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังต่อไป การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ amylose / amylopectin content (waxy gene) ที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์เม็ดแป้ง อมิโลสจะถูกควบคุมโดยยีน Waxy (Wx) ส่วนแป้งอมิโลเพคตินซึ่งมีโครงสร้างที่แตกแขนง (branching) จะถูกควบคุมโดยยีน Sbe พบว่าคู่ไพรเมอร์ Sbe (F+R) สามารถเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ amylopectin ในพันธุ์ข้าวเหนียวหนองคาย และข้าวขาวดอกมะลิ 105 ได้ขนาดชิ้นของผลผลิต PCR ประมาณ 500 pb จากการโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ amylose/amylopectin สามารถใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบขึ้นเองและที่ได้จากฐานข้อมูลทางอินเทอร์เนตสามารถพบยีนนี้ได้ทั้งในพันธุ์ข้าวเหนียวและข้าวเจ้า และชิ้นส่วนของยีน Waxy (Wx gene) ที่ได้มาแล้ว คาดว่าสามารถนำไปใช้ประโยชน์ในการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังต่อไปในอนาคต การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะการผลิตน้ำตาลเพื่อการถ่ายฝาก ในมันสำปะหลัง การโคลนยีนที่เกี่ยวข้องกับลักษณะการผลิตน้ำตาล คือ Sucrose Phosphate Synthase ( SPS ) เป็นเอนไซม์ที่มีกลไกในการควบคุมการสะสมและการเคลื่อนย้ายคาร์บอนซึ่งเป็นวัตถุดิบที่สำคัญสำหรับใช้ในกระบวนการสังเคราะห์แสง เพื่อนำไปใช้ในการสังเคราะห์น้ำตาลและคาร์โบไฮเดรตในพืช การโคลนยีน Sucrose Phosphate Synthase จากอ้อย ได้ขนาด 2,960 คู่เบส ทำการเชื่อมต่อยีนที่ได้กับ Plant Expression Vector ( pCAMBIA2300 ) ที่ประกอบด้วย โปรโมเตอร์ ( 35SCaMV ) และเทอร์มิเนเตอร์ ( NOS ) ได้พลาสมิดสายผสม ( pCAMBIA2300 – SPS ) ขนาดประมาณ 12.6 กิโลเบส สำหรับนำไปถ่ายฝากลงในมันสำปะหลัง หรือพืชชนิดอื่นๆ ที่สนใจ เช่น อ้อย ข้าวฟ่าง เพื่อเพิ่มศักยภาพในการผลิตน้ำตาลให้สูงขึ้นต่อไปในอนาคต งานด้านสำรวจและรวบรวมเชื้อจุลินทรีย์ที่สามารถตรึงไนโตรเจนและละลายฟอสเฟตในพื้นที่ปลูกมันสำปะหลังโดยใช้เทคนิคชีวโมเลกุล พบว่าเชื้อแบคทีเรียที่สามารถละลายฟอสเฟตได้มากที่สุดคือ Burkholderia cenocepacia ละลายได้ 72.62 mg P L-1 และเชื้อราที่สามารถละลายฟอสเฟตได้มากที่สุดคือ Penicillium oxalicum ละลายได้ 75.29 mg P L-1 การศึกษารวบรวมและพัฒนาสายพันธุ์จุลินทรีย์ที่มีประสิทธิภาพเพื่อการผลิตเอทานอลในมันสำปะหลัง ทำการแยกเชื้อราจากตัวอย่างดินที่เก็บมาจากแปลงปลูกมันสำปะหลังในภูมิภาคต่างๆ สามารถคัดเลือกราที่มีประสิทธิภาพย่อยแป้งดิบได้ดี ได้แก่ Aspergillus niger จำนวน 14 ไอโซเลท Mycocladus corymbiferus จำนวน 1 ไอโซเลท Rhyzopus oryzae จำนวน 1 ไอโซเลท Syncephalastrum racemosum จำนวน 1 ไอโซเลท Trichoderma asperellum จำนวน 3 ไอโซเลท และ T. viridae จำนวน 1 ไอโซเลท ซึ่งสามารถนำไปใช้ย่อยแป้งมันสำปะหลังดิบเพื่อเปลี่ยนให้เป็นน้ำตาลแล้วจึงทำการหมักด้วยยีสต์ให้กลายเป็นเอทานอลหรือนำราเหล่านี้ไปผลิตเอนไซม์กลูโคอะไมเลสที่มีประสิทธ์ภาพในการย่อยแป้งดิบต่อไป การพัฒนาสายพันธุ์ยีสต์ที่มีประสิทธิภาพสำหรับการผลิตเอทานอลในหัวมันสำปะหลังสด ทำการรวบรวมและจำแนกเชื้อยีสต์ (Saccharomyces cerevisiae) ที่จำแนกได้ ไปทดสอบการผลิต เอทานอล โดยการหมักด้วยอาหาร YPD ที่เติม กลูโคส 18% คัดเลือกตัวอย่างเชื้อที่ให้เอทานอล สูง 6 ไอโชเลต คือ CT1, CT 2, CT3,RW1,RW3 และ RW4 ทำการปรับปรุงสายพันธุ์ยีสต์ให้สามารถทนทานเอทานอลได้สูง ด้วยเทคนิคมิวเตชั่น โดยนำยีสต์ RW1,RW3, RW4 และP18 ให้ได้แสง UV นาน 6 นาที และ ร่วมกับการใช้สารก่อกลายพันธุ์ Ethidium bromide แล้วคัดเลือกบนอาหาร YPD ที่ผสมเอทานอล ตั้งแต่ 5-20% ได้คัดเลือกเชื้อยีสต์ที่สามารถทนเอทานอลได้ 15% และผลิตเอทานอลสูงกว่าเชื้อเปรียบเทียบ 40 โคลน และพบว่า เชื้อยีสต์สายพันธุ์กลายที่ผลิตเอทานอลได้สูงส่วนใหญ่มีความเสถียรหลังทำการเลี้ยงต่อเนื่องกัน 10 ชั่ว(generations) การใช้ Molecular เทคนิคในการเปลี่ยนพันธุกรรมของยีสต์ให้ทนเอทานอลสูงโดยการใช้เทคนิค homologus recombination ใช้ยีน URA3 แทนที่ยีน GAL1 บนโครโมโชมของยีสต์ พบว่ายีสต์ที่ไม่มียีน GAL1 สามารถผลิตเอทานอลได้สูงกว่าพันธุ์ปกติ แต่ไม่มีผลช่วยเพิ่มระดับความทนทานต่อเอทานอล การโคลนยีน cellulase จากเห็ด เพื่อพัฒนาการผลิตเอนไซม์เซลลูเลสสำหรับผลิตเอทานอลจากชีวมวล ได้ทดสอบประสิทธิภาพของยีนเซลลูเลสจากเห็ดชนิดต่าง ๆ 5 ชนิด ในอาหาร CMC agar ที่มีเซลลูโลสเป็นองค์ประกอบ พบว่า เห็ดขอนขาว เห็ดกระด้าง เห็ดโคนน้อย และเห็ดแครง สามารถย่อยเซลลูโลสได้ดี ส่วนเห็ดฟางย่อยได้เพียงเล็กน้อย จึงคัดเลือกเห็ด 4 ชนิดดังกล่าวมาโคลนยีนเซลลูเลส พบว่าสามารถเพิ่มปริมาณยีนคือ ยีนcellobiohydrolase (?Cel) มีขนาด 565 คู่เบส lobiohydrolase (Cel3AC) มีขนาด 533 คู่เบส คือ cellobiohydrolase (cbhISc) มีขนาด 1200 คู่เบส และยีน cellulase (FOXCel) ขนาด 1175 คู่เบส นำไปทดสอบการสร้างเอนไซม์ในระบบเวคเตอร์ของยีสต์ (yeast expression system) ต่อไป การพัฒนา Bacillus sp. เพื่อใช้ในการผลิตเอนไซม์อะไมเลสโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพ คัดแยกและเก็บรวบรวม Bacillus spp. ได้ทั้งสิ้น 476 ไอโซเลท ทำการศึกษากิจกรรมของเอนไซม์อะไมเลสแล้ว พบว่า ไอโซเลท D1-1 มี ประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซม์อะไมเลสไดดีที่สุด มีค่า specific activity เท่ากับ 2.19 U/mg protein จำแนกชนิด ของ Bacillus sp. ไอโซเลท D1-1 พบว่ามีความคล้ายคลึงกับ Bacillus subtilis จากนั้นทำการเพิ่ม ปริมาณส่วนของยีนอะไมเลสด้วยเทคนิค PCR พบชิ้นส่วนของยีนที่ได้มีขนาด 1,980 คู่เบส ทำการตัดชิ้นส่วนของยีนด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ KpnI และ HindIII เพื่อนำมาเชื่อมต่อเข้ากับ Expression vector pQE-80L (Qiagen) ตรวจสอบการแสดงออกของโปรตีนด้วยวิธี SDS-PAGE พบว่าโปรตีนที่ได้ มีขนาด 72 kDa crude enzyme ที่ผลิตได้มีกิจกรรมของเอนไซม์ที่ดี สามารถทนต่ออุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียส หลังจากนั้นนำส่วนของ crude enzyme มาทำบริสุทธิ์โดยใช้ NiNTA column ได้เอนไซม์ที่บริสุทธิ์ขนาด 72 kDa การผลิตเอนไซม์อะไมเลสจากเชื้อจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับการย่อยแป้ง ได้รวบรวมตัวอย่างเชื้อจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับการผลิตเอนไซม์อะไมเลส ได้แก่ Bacillus amyloliquefaciens , B. licheniformis และ ยีสต์ (Saccharomyces cerevisiae ) และเชี้อแบคทีเรียที่เก็บได้จากลานมันสำปะหลังจำนวน 7 ไอโซเลท ศึกษาสูตรอาหารสำหรับผลิตเอนไซม์อะไมเลสโดยใช้แป้งต่างชนิดกันจำนวน 7 ชนิด พบเชื้อแบคทีเรียย่อยแป้งมันสำปะหลังได้ดีที่สุด รองลงมา คือ มันสำปะหลังอบแห้งบดละเอียด และ Starch soluble ตามลำดับ จึงได้ทดลองใช้แป้งทั้ง 3 ชนิดเป็นวัตถุดิบเพื่อผลิตเอนไซม์อะไมเลสกับเชื้อแบคทีเรีย จำนวน 8 ไอโซเลท ได้แก่ ST1516, ST1045, D1-1, RK1-RK5 ทำการเพิ่มปริมาณเซลล์แบคทีเรียและสกัดเอนไซม์หยาบ และได้ศึกษาวิธีการแยกเอนไซม์อะไมเลสให้บริสุทธิ์ด้วยเครื่อง Tangential Flow Filtration (TFF) และตรวจสอบความบริสุทธิ์ของเอนไซม์โดยวิธี (SDS-PAGE) พบว่า อาหารจากแป้งมันพบชิ้นของโปรตีนเห็นได้ชัดเจนทุกไอโซเลท รองลงมา อาหาร Soluble starch และ อาหารจากมันสำปะหลังอบแห้งบดละเอียด และตัวอย่างที่ผลิตเอนไซม์ได้มากที่สุดคือ RK2 ซึ่งพบความเข้มของแบนชัดเจนในทุกอาหารแป้งซึ่งมีขนาดชิ้นโปรตีนประมาณ 70 kDa และผลการทดลองตัวอย่างที่ผลิตเอนไซม์ได้สูงสามารถนำไปใช้เป็นแนวทางศึกษากระบวนการหมักร่วมกับยีสต์เพื่อลดขั้นตอนกระบวนการผลิตเอทานอลให้เร็วขึ้น การผลิตเอนไซม์อะไมเลสจากดีเอ็นเอ Recombinant ใน Escherichia coli1 ปัจจุบันมีการใช้เทคนิครีคอมบิแนนท์โปรตีน (recombinant protein technology) เข้ามาช่วย ในการผลิตโปรตีนให้มีคุณสมบัติหรือปริมาณที่ต้องการได้ โดยนิยมผลิตโปรตีนในเซลล์เจ้าบ้านต่างๆ เช่น เซลล์พืช ยีสต์ หรือแบคทีเรีย กลูโคอะไมเลสเป็นเอนไซม์ที่สามารถย่อยได้ทั้งแป้งดิบและสุก ซึ่งมี ประโยชน์ต่อขบวนการผลิตเอทานอลจากมันสำปะหลัง งานวิจัยในครั้งนี้มีวัตถุประสงค์โคลนยีนกลูโคอะไมเลสจากเชื้อราและศึกษาการแสดงออกของยีนนี้ใน Escherichia coli เพื่อการผลิต เอนไซม์กลูโคอะไมเลสเชิงพาณิชย์ในอนาคต โดยนำเชื้อรา Aspergillus niger ซึ่งได้ผ่านการคัดเลือก เบื้องต้นแล้วว่าสามารถย่อยแป้งได้ดี นำมาสกัด mRNA และเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนของยีนกลูโค อะไมเลส ได้แถบดีเอ็นเอขนาด 1,923 คู่เบส โคลนเข้ากับพาหะ CloneJET? PCR Cloning Kit (Fermentas, USA) จากนั้นทำการโคลนยีนเข้ากับ TOPO? expression vector (Invitrogen, USA) เพื่อผลิต รีคอมบิแนนท์กลูโคอะไมเลสในเซลล์แบคทีเรีย ชักนำด้วย สาร IPTG เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จึงได้โปรตีนสูงสุด เข้มข้น 7.70 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร โปรตีนรวมเท่ากับ 28.87 มิลลิกรัม จากอาหารเลี้ยงเซลล์ 1 ลิตร การสร้าง regeneration system เพื่อการถ่ายยีนในมันสำปะหลัง ในการถ่ายยีนเข้าสู่มันสำปะหลัง พบว่าชิ้นส่วนของ apical meristem และ lateral bud สามารถชักนำให้เกิด somatic embryo ได้ โดย ชิ้นส่วน apical meristem มีอัตราการเกิด somatic embryo สูงสุด 31% บนอาหาร MS ที่เติม 2,4-D 30 ?M ในขณะที่ชิ้นส่วน lateral bud เกิด somatic embryo ได้ น้อยสุด 8% บนอาหารที่เติม picloram 20 ?M somatic embryo ที่เกิดขึ้นมีลักษณะ เป็นก้อนกลม สีขาวขุ่น มีขนาดเล็กมากปะปนกับแคลลัส ต้องดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ และเมื่อแยก somatic embryo ออกมาจากแคลลัส นำมาเลี้ยงบนอาหาร MS ที่เติม BA 0.5 ?M สามารถพัฒนาเป็นใบเลี้ยงและต้นอ่อนได้ ดังนั้นจึงสามารถใช้ การเกิด somatic embryo เพื่อการถ่ายยีนเข้าสู่มันสำปะหลัง การสร้าง Plasmid construct เพื่อการถ่ายยีนเข้าสู่มันสำปะหลัง1 วัตถุประสงค์ของงานวิจัยในครั้งนี้ เป็นการสร้างพลาสมิดพาหะที่เหมาะสมและไม่เป็นปัญหาเรื่อง สิทธิบัตร เพื่อใช้ในการถ่ายยีนเข้าสู่มันสำปะหลัง ซึ่งมียีนคัดเลือกเป็นยีนต้านทานสารปฏิชีวนะ ไฮโกรมัยซิน (hpt II gene) และยีนเรืองแสงสีเขียว (gfp gene) โดยโคลนยีน hpt II จากเวคเตอร์ pCAMBIA 1301 ด้วยเทคนิค PCR จัดทำ plasmid construct โดยตัดเอาส่วน ของโปรโมเตอร์และยีน npt II ออกจากเวคเตอร์ pBI121 และเชื่อมต่อ CaMV 35S promoter/hpt II gene และ CaMV 35S promoter/ GFP gene เข้ากับเวคเตอร์ pBI121 ได้ recombinant plasmid pBHPT และ pBGFP ตามลำดับและสามารถสอดแทรกยีนอื่นๆ เข้าสู่ pBHPT และ pBGFP เพื่อใช้ในการถ่ายยีนเข้าสู่ พืชได้ โดยแทรกยีนเข้าที่ตำแหน่งเอนไซม์ตัดจำเพาะ (Multiple cloning site ; MCS) คือ XbaI, BamHI, XmaI และ SmaI
บทคัดย่อ (EN):	No information found from agency.
ปีเริ่มต้นงานวิจัย:	2549-10-01
ปีสิ้นสุดงานวิจัย:	2553-09-30
ลิขสิทธิ์:	แสดงที่มา-ไม่ใช้เพื่อการค้า-ไม่ดัดแปลง 3.0 ประเทศไทย (CC BY-NC-ND 3.0 TH)
เผยแพร่โดย:	กรมวิชาการเกษตร
บทคัดย่อ:	ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN):	th

หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

กรมวิชาการเกษตร. (2553). โครงการวิจัยการศึกษาความหลากหลายและการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพApplication of Biotechnology for Genetic Diversity and Breeding in Cassava. กรมวิชาการเกษตร

กรมวิชาการเกษตร. "โครงการวิจัยการศึกษาความหลากหลายและการปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลังโดยใช้เทคโนโลยีชีวภาพApplication of Biotechnology for Genetic Diversity and Breeding in Cassava". กรมวิชาการเกษตร. 2553

งานวิจัยที่เกี่ยวกับ เทคโนโลยีชีวภาพ และ การศึกษาเฉพาะทาง

งานวิจัยที่เกี่ยวกับ การปรับปรุงพันธุ์มันสำปะหลัง และ การศึกษาเฉพาะทาง

งานวิจัยที่เกี่ยวกับ โครงการวิจัย และ การศึกษาเฉพาะทาง

TARR Wordcloud:

ผู้แต่ง กรมวิชาการเกษตร

เผยแพร่โดย

กรมวิชาการเกษตร

เผยแพร่เมื่อ 30 กันยายน 2553

หน่วยงาน กรมวิชาการเกษตร

แสดงที่มา-ไม่ใช้เพื่อการค้า-ไม่ดัดแปลง 3.0 ประเทศไทย (CC BY-NC-ND 3.0 TH)

คัดลอก URL

กระทู้ของฉัน

ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์ เรียงลำดับจาก

พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)

แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair