สืบค้นงานวิจัย
การปรับปรุงความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromanas hydrophila โดยวิธี site directed mutagenesis
Jeerapan Machaopa - จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
ชื่อเรื่อง: การปรับปรุงความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromanas hydrophila โดยวิธี site directed mutagenesis
ชื่อเรื่อง (EN): Thermostability improvement of alanine dehydrogenase from Aeromanas hydrophila by site directed mutagenesis
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Jeerapan Machaopa
บทคัดย่อ: อะลานีนดีไฮโดรจิเนส (EC 1.4.1.1) เร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากแอล-อะลานีนให้ผลิตภัณฑ์คือแอมโมเนียม, ไพรูเวท และ NADH ซึ่งเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้และต้องการ NAD[superscript +] เป็นโคเอนไซม์ จากปฏิกิริยาดังกล่าวจึงได้มีการนำเอนไซม์นี้มาใช้ในการสังเคราะห์กรดอะมิโน รวมทั้งนำมาประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัยโรค อะลานีนดีไฮโดรจิเนสที่แยกได้จาก Aeromonas hydrophila มีแอคติวิตีและความจำเพาะต่อสับสเตรทสูงเหมาะสมสำหรับใช้ผลิตกรดอะมิโน แต่อย่างไรก็ตามแอคติวิตีของเอนไซม์ลดลงอย่างรวดเร็วหลังจากการบ่มที่อุณหภูมิสูงกว่า 55 องศาเซลล์เซียส เป็นเวลา 10 นาที ดังนั้นจึงทำการปรับปรุงอะลานีนดีไฮโดรจิเนสให้มีความเสถียรต่ออุณหภูมิสูงขึ้นโดยใช้วิธี site-directed mutagenesis เพื่อเปลี่ยนกรดอะมิโน ที่ตำแหน่ง ไกลซีน 38, ลูซีน 101 และอะลานีน 231 เป็น กรดกลูตามิค นอกจากนี้ยังเปลี่ยนที่ ลูซีน 58 และโพรลีน 168 เป็นอาร์จินีน เพื่อการเกิดพันธะอิเลกโทรสแตติก ในโปรตีนซึ่งมีรายงานว่าเป็นปัจจัยสำคัญต่อความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนส โดยเปรียบเทียบกับพันธะที่พบในเอนไซม์จากแบคทีเรียทนร้อน Bacillus stearothermophilus จากการทดลองในสารละลาย เอนไซม์หยาบพบว่าเอนไซม์ที่เปลี่ยนแปลงตำแหน่ง ลูซีน 101 หรือ อะลานีน 231 เป็นกรดกลูตามิค ทนร้อนมากกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม แต่ถ้าเปลี่ยนไกลซีน 38 เป็นกรดกลูตามิคไม่มีผลต่อการทนร้อน ในขณะที่การเปลี่ยนลูซีน 58 หรือโพรลีน 168 เป็นอาร์จินีน มีผลให้เอนไซม์สูญเสียคุณสมบัติทนร้อน ดังนั้นจึงได้ทำการเปลี่ยนกรดอะมิโนทั้งสองตำแหน่งพร้อมกัน (ลูซีน 101 และอะลานีน 231) พบว่าทำให้ความเสถียรเพิ่มสูงขึ้น จากนั้นนำเอนไซม์ที่ให้ผลทนร้อนดีขึ้นมาทำให้บริสุทธิ์ เมื่อวิเคราะห์ด้วยอิเลกโทรโฟรีซิสแบบไม่เสียสภาพพบว่าเอนไซม์มีความบริสุทธิ์มากกว่า 90% และแต่ละเอนไซม์ที่เปลี่ยนแปลงมีการเคลื่อนที่ต่างจากเอนไซม์ดั้งเดิม ซึ่งเป็นผลจากการเพิ่มประจุลบบนโมเลกุลของเอนไซม์ ขณะที่การเคลื่อนที่ของเอนไซม์จากการทำอิเลกโทรโฟรีซิสแบบเสียสภาพให้ผลไม่แตกต่างจากเอนไซม์ดั้งเดิม การศึกษาความเสถียรต่อความร้อนซึ่งใช้ค่า T[subscript m] เป็นค่าแสดงความเสถียร พบว่าเอนไซม์ที่มีการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนทั้งสองตำแหน่ง (ลูซีน 101 และอะลานีน 231) แสดงค่า T[subscript m] สูงกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม 3 องศาเซลล์เซียส ส่วนเอนไซม์ที่เปลี่ยนแปลงตำแหน่งเดียวให้ผลเพิ่มขึ้น 2 องศาเซลล์เซียส นอกจากนี้ยังพบว่าอุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ถูกเปลี่ยนแปลงทั้งหมดมีการเพิ่มขึ้นจากเดิม 50 องศาเซลล์เซียส เป็น 52.5 องศาเซลล์เซียส แต่ผลของ pH ...
บทคัดย่อ (EN): Alanine dehydrogenase (EC 1.4.1.1) catalyzes the NAD[superscript +]- dependent reversible oxidative deamination of L-alanine to form ammonia, pyruvate, and NADH. The enzyme is important as a catalyst for the synthesis of amino acids. Moreover, it is therefore applicable to diagonosis of malignant hematopoietic disease. Alnine dehydrogenase from Aeromonas hydrophila has high activity and high substrate specificity, so it is suitable for L-alanine production. However, the enzyme activity lost rapidly upon the incubation at temperature above 50 ํC for 10 min. To improve the enzyme thermostability, site-directed mutagenesis was performed. Uncharged amino acids were replaced by charge residues. G38E, L58R, L101E, P168R and A231E were selected for electrostatic interaction formation based on three dimensional structure of thermophilic counterpart enzyme from Bacillus stearothermophilus. In crude enzyme, L101E and A231E showed higher stability than wild type. While G38E showed similar enzyme level with wild type, L58R and P168R showed lower. Thus, residues of Leu 58 and A231 were chosen for double mutation. Alanine dehydrogenase from L101E, A231E and L101E/Arg231 were purified for comparison of their characters with wild type. The purity of wild type and all mutant enzymes were more than 90%, estimated by native PAGE. Mobility of mutant enzymes on native gel was faster than that of wild type. Whereas, no difference was detected by SDS-PAGE. This evidence reflected the net charge on molecule of enzymes. T[subscript m] of L101E/A231E increased 3 ํC while single mutants showed 2 ํC higher than wild type. Furthermore, optimum temperature of mutants shifted up from 50 ํC in wild type to 52 ํC. The optimum pH, substrate specificity and kinetic properties (K[subscript m]) for L-alanine and NAD[superscript +] of all mutants were not differed from wild type, so no change in an active site of enzyme was occurred. Thus, replacement of Leu 101 and Ala 231 with Glu could form electrostatic interaction which could enhance thermostability.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://thailis-db.car.chula.ac.th/CU_DC/September2005/thesis/Jeerapan.pdf
เผยแพร่โดย: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
คำสำคัญ (EN): Site directed mutagenesis
เจ้าของลิขสิทธิ์: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
รายละเอียด: อะลานีนดีไฮโดรจิเนส (EC 1.4.1.1) เร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากแอล-อะลานีนให้ผลิตภัณฑ์คือแอมโมเนียม, ไพรูเวท และ NADH ซึ่งเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้และต้องการ NAD[superscript +] เป็นโคเอนไซม์ จากปฏิกิริยาดังกล่าวจึงได้มีการนำเอนไซม์นี้มาใช้ในการสังเคราะห์กรดอะมิโน รวมทั้งนำมาประยุกต์ใช้ในการวินิจฉัยโรค อะลานีนดีไฮโดรจิเนสที่แยกได้จาก Aeromonas hydrophila มีแอคติวิตีและความจำเพาะต่อสับสเตรทสูงเหมาะสมสำหรับใช้ผลิตกรดอะมิโน แต่อย่างไรก็ตามแอคติวิตีของเอนไซม์ลดลงอย่างรวดเร็วหลังจากการบ่มที่อุณหภูมิสูงกว่า 55 องศาเซลล์เซียส เป็นเวลา 10 นาที ดังนั้นจึงทำการปรับปรุงอะลานีนดีไฮโดรจิเนสให้มีความเสถียรต่ออุณหภูมิสูงขึ้นโดยใช้วิธี site-directed mutagenesis เพื่อเปลี่ยนกรดอะมิโน ที่ตำแหน่ง ไกลซีน 38, ลูซีน 101 และอะลานีน 231 เป็น กรดกลูตามิค นอกจากนี้ยังเปลี่ยนที่ ลูซีน 58 และโพรลีน 168 เป็นอาร์จินีน เพื่อการเกิดพันธะอิเลกโทรสแตติก ในโปรตีนซึ่งมีรายงานว่าเป็นปัจจัยสำคัญต่อความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนส โดยเปรียบเทียบกับพันธะที่พบในเอนไซม์จากแบคทีเรียทนร้อน Bacillus stearothermophilus จากการทดลองในสารละลาย เอนไซม์หยาบพบว่าเอนไซม์ที่เปลี่ยนแปลงตำแหน่ง ลูซีน 101 หรือ อะลานีน 231 เป็นกรดกลูตามิค ทนร้อนมากกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม แต่ถ้าเปลี่ยนไกลซีน 38 เป็นกรดกลูตามิคไม่มีผลต่อการทนร้อน ในขณะที่การเปลี่ยนลูซีน 58 หรือโพรลีน 168 เป็นอาร์จินีน มีผลให้เอนไซม์สูญเสียคุณสมบัติทนร้อน ดังนั้นจึงได้ทำการเปลี่ยนกรดอะมิโนทั้งสองตำแหน่งพร้อมกัน (ลูซีน 101 และอะลานีน 231) พบว่าทำให้ความเสถียรเพิ่มสูงขึ้น จากนั้นนำเอนไซม์ที่ให้ผลทนร้อนดีขึ้นมาทำให้บริสุทธิ์ เมื่อวิเคราะห์ด้วยอิเลกโทรโฟรีซิสแบบไม่เสียสภาพพบว่าเอนไซม์มีความบริสุทธิ์มากกว่า 90% และแต่ละเอนไซม์ที่เปลี่ยนแปลงมีการเคลื่อนที่ต่างจากเอนไซม์ดั้งเดิม ซึ่งเป็นผลจากการเพิ่มประจุลบบนโมเลกุลของเอนไซม์ ขณะที่การเคลื่อนที่ของเอนไซม์จากการทำอิเลกโทรโฟรีซิสแบบเสียสภาพให้ผลไม่แตกต่างจากเอนไซม์ดั้งเดิม การศึกษาความเสถียรต่อความร้อนซึ่งใช้ค่า T[subscript m] เป็นค่าแสดงความเสถียร พบว่าเอนไซม์ที่มีการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโนทั้งสองตำแหน่ง (ลูซีน 101 และอะลานีน 231) แสดงค่า T[subscript m] สูงกว่าเอนไซม์ดั้งเดิม 3 องศาเซลล์เซียส ส่วนเอนไซม์ที่เปลี่ยนแปลงตำแหน่งเดียวให้ผลเพิ่มขึ้น 2 องศาเซลล์เซียส นอกจากนี้ยังพบว่าอุณหภูมิที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่ถูกเปลี่ยนแปลงทั้งหมดมีการเพิ่มขึ้นจากเดิม 50 องศาเซลล์เซียส เป็น 52.5 องศาเซลล์เซียส แต่ผลของ pH ...
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Jeerapan Machaopa. "การปรับปรุงความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromanas hydrophila โดยวิธี site directed mutagenesisThermostability improvement of alanine dehydrogenase from Aeromanas hydrophila by site directed mutagenesis". จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. 2546

Jeerapan Machaopa. "การปรับปรุงความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromanas hydrophila โดยวิธี site directed mutagenesisThermostability improvement of alanine dehydrogenase from Aeromanas hydrophila by site directed mutagenesis". จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. 2546. Print.



TARR Wordcloud:
การปรับปรุงความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromanas hydrophila โดยวิธี site directed mutagenesis
Jeerapan Machaopa
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
2546
การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter Lwoffii และความเป็นไปได้ในการผลิตกรดอะมิโน การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของลูซีนดีไฮโดรจิเนส จาก Alcaligenes faecalis การปรับปรุงกระบวนการโอเลฟินไฮโดรจิเนชันและลดการสูญเสียสารอะโรเมติกส์ในอุตสาหกรรมการผลิตเบนซีน โทลูอีน และไซลีน การเปรียบเทียบความไวของ PCR วิธีต่าง ๆ ในการแยกสายพันธุ์ของเชื้อจิอาร์เดียดูโอดีนาลิส การวิเคราะห์ปริมาณไรโบฟลาวิน, ฟลาวิน อะดีนีน ไดนิวคลีโอไทด์, ฟลาวิน โมโนนิวคลีโอไทด์ เคลนบูเทอรอลและซาลบูทามอลด้วยเทคนิคแคปิลารีอิเลคโทรโฟรีซีส การวิเคราะห์การกลายพันธุ์และแฮปโปลทัยป์ของยีนสร้างกลูโคส - 6 -ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนสในประชากรเอเซียตะวันออกเฉียงใต้ บทบาทของเซ็นทรัลอะมิกดะลาและเม็ดดัลลาริราเฟ่ในการตอบสนองต่อการเต้นเร็วขึ้นของหัวใจที่มีผลมาจากความเครียด การอบแห้งลำไยทั้งเปลือกด้วยวิธีปั๊มความร้อนร่วมกับอินฟราเรด ผลของเบนซิลอะดีนินและเนฟทาลีนอะซิติคแอซิคต่ออายุการปักแจกันของดอกกล้วยไม้ Dendrobium Walter Oumae 4N การผลิตน้ำตาลซอร์โบสด้วยแบคทีเรียอะซิติกทนร้อน
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair