สืบค้นงานวิจัย
การสร้าง infectious clones ของไวรัส Infectious myonecrosis virus (IMNV) และการผลิตไวรัส IMNV ของกุ้ง ในเซลล์แมลงเพาะเลี้ยงโดยใช้ Baculovirus vector เป็นตัวช่วย
ชุมพร สุวรรณยาน - มหาวิทยาลัยมหิดล
ชื่อเรื่อง: การสร้าง infectious clones ของไวรัส Infectious myonecrosis virus (IMNV) และการผลิตไวรัส IMNV ของกุ้ง ในเซลล์แมลงเพาะเลี้ยงโดยใช้ Baculovirus vector เป็นตัวช่วย
ชื่อเรื่อง (EN): Baculovirus mediated production of infectious myonecrosis virus (IMNV) infectious clones and IMNV of shrimp in insect and in cultured insect cells
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ: ชุมพร สุวรรณยาน
ผู้ร่วมงาน / ผู้ร่วมวิจัย:
  1. วราชินย์ กางโนนงิ้ว
  2. สุริยพงศ์ แจ่มใส
คำสำคัญ: กุ้งขาว
คำสำคัญ (EN): IMNV
บทคัดย่อ: เชื้อไวรัส Infectious myonecrosis (IMNV) เป็นไวรัสขอกุ้งทะเลในสกุล penaeid ที่ก่อให้เกิดความเสียหายทางเศษฐกิจอย่างมากแก่ฟาร์มกุ้งในประเทศบราซิลและอินโดนีเซีย การศึกษาฝการจัดการกับพัฯธุกรรมของไวรัส IMNV ทำได้ยากเพราะยังไม่มี IMNV full-length cDNA clone และขาด cell line ของกุ้งซึ่งทำให้การศึกษาการติดเชื้อไวรัสในระดับโมเลกุลทำได้ยาก ในโครงการนี้มีเป้าหมายในการสร้าง full-length cDNA clones ของเชื้อ IMNV และทดสอบความสามารถในการติดเชื้อของโคลนดังกล่าวในเซลล์แมลงเพาะเลี้ยงโดยใช้วิธีทาง reverse genetic ซึ่งในการสร้าง clones ของเชื้อ IMNV ที่มีความยาวเท่ากับขนาดของ genome นั้นคณะผู้วิจัยได้ทำการสกัด RNA จากกุ้งขาวที่ติดเชื้อ IMNV จากประเทศอินโดนีเซียก่อนจะเปลี่ยน ให้เป็น cDNA แล้วจึงใช้ cDNA นี้เป็นต้นแบบในการเพิ่มชิ้น DNA ที่เหมือนกับ genome ของ IMNV ด้วยวิธี PCR โดยใช้ primer สองคู่ที่ครอบคลุมทั้ง genome ของไวรัสและมีลำดับเบสซ้อนทับกันบางส่วน (overlapping sequences) จากนั้นทำการเอาชิ้นส่วนทั้งสองชิ้นที่เพิ่มจำนวนได้ไปเสียบเข้าไปใน pPrime cloning vector แล้วจึงนำไป transform competent DH5? E. coli cells จากนั้นนำเซลล์ที่ transform แล้วไปเลี้ยงแล้วจึงคัดหา colony ที่มีชิ้นของ IMNV cDNA ไปเลี้ยงแล้วทำการสกัดเอาพลาสมิด ก่อนนำ plasmid ที่ไปตัดแล้วจึงนำไปใช้ในการเป็นแบบในการเพิ่มชิ้นส่วน DNA ด้วยวิธี PCR โดยใช้ ไพรเมอร์อีกสองคู่ที่เป็น infusion ไพรเมอร์ โดยไพรมเมอร์คู่แรกมีฟอร์วอดไพรเมอร์ที่มีลำดับเบสเหมือนกับของ pFast Bac HT B vector ที่บริเวณที่จะเสียบ IMNV เข้าไปจำนวน 15 เบสและเหมือนกับของ IMNV genome ที่ปลายด้าน 5’ ส่วนของ reverse ไพร์มเมอร์นั้นมีลำดับเบสที่เหมือนกับ15เบสแรกของปลาย 5’ ของ IMNV genome ชิ้นที่สอง ส่วนไพร์มเมอร์คู่ที่สองประกอบด้วย forward primer ที่มีลำดับเบส 15 เบสแรกเหมือนกับปลาย 3’ ของ IMNV genome ชิ้นแรกหรือลำดับเบสเหมือนปลาย 5’ ของ reverse ไพร์มเมอร์ของไพร์มเมอร์คู่แรกและ ปลาย 5’ของ IMNV genome ชิ้นที่ 2 และ reverse primer ที่มีลำดับเบสเหมือนกับปลาย 3’ end ของ IMNV genome และปลาย 3’ pFAST Bac HT B vector ตรงบริเวณที่จะเสียบชิ้น IMNV genomic cDNA เข้าไป จากนั้นนำเอาชิ้นของ DNA ที่เพิ่มจำนวนได้ไปเสียบเข้าไปใน pFast Bac HT B vector ที่ได้ทำการตัดไว้แล้ว โดยที่การเสียบนี้ใช้ In-fusion? cloning kit (Clontech, USA) ช่วยให้ได้ plasmid ลูกผสม pFastBac HT B- IMNV ซึ่งได้นำไปขยายหรือเพิ่มปริมาณของชิ้นของ DNA โดยการนำไปเข้าใน E. coli สายพันธุ์ Stellar? จากนั้นคัดเอาเซลล์ E. coli ที่มี pFastBac HT B- IMNV ไปเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนก่อนจะเอาไปสกัดพลาสมิดแล้วจึงนำพลาสมิดไปตรวจสอบว่ามี insert ที่ถูกต้องหรือไม่ด้วยใช้วิธี PCR Cells โดยใช้ไพร์เมอร์ที่จำเพาะต่อช่วงต่อกันระหว่างตัว Vector กับ IMNV และระหว่าง IMNV ชิ้นที่หนึ่งและชิ้นที่สอง จากนั้นนำเอาพลาสมิดที่มี IMNV insert ถูกต้องแล้วไปใช้เป็น donor หรือ transfer vector โดยเอาไปใส่เข้าไปใน E. coli สายพันธุ์ DH10 Bac ที่มี baculovirus genome (Bacmid) และ helper plasmid ซึ่ง helper plasmid นี้จะช่วยในการเอา IMNV genome sequence เสียบเข้าไปใน Bacmid DNA จากนั้นนำ Bacmid-IMNV DNA ลูกผสมที่ได้ไปใส่เข้าไปใน (transfect) เซลล์แมลง Sf9 จากนั้นก็ตรวจดพยาธิสภาพของเซลล์ทุกวัน ลักษณะความผิดปกติของเซลล์หรือ cytopathic effects (CPE) ซึ่งได้แก่การหยุดการแบ่งตัว การเพิ่มขนาดและการตายของเซลล์ จากนั้นก็เอาน้ำเลี้ยงเซลล์ที่น่าจะมาทำ (น่าจะมี IMNV และ recombinant baculovirus) การ infect เซลล์ SF9 ใหม่ จาการตรวจดูเซลล์ที่ถูก infect พบว่ามี CPE เกิดขื้น สองวันหลังจากการใส่เชื้อ การตรวจด้วย Immune-cytochemical study โดยใช้ antibody ต่อ IMNV nucleo-capsid protein พบว่ามีปฎิกิริยาที่เข้มมากทั้งใน cytoplasm และ nuclei ของเซลล์ติดเชื้อ การตรวจดุเซลล์ติดเชื้อและไวรัสที่แยกได้จากน้ำเลี้ยงเซลล์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องผ่าน พบว่ามีอนุภาคของของไวรัส IMNV ใน Cytoplasm vesicle และ ในไวรัสที่แยกบริสุทธิ์ จาก น้ำเลี้ยงเซลล์ของเซลล์ติดเชื้อและพบ baculovirus ใน nucleus ของทุกเซลล์ติดเชื้อ จากผลการศึกษาที่ได้ชี้ให้เห็นว่าเราสามารถผลิตไวรัสในเซลล์ที่ไม่ใช่ host ตามธรรมชาติของไวรัสได้
บทคัดย่อ (EN): Infectious myonecrosis virus (IMNV) is a virus of penaeid shrimp that causes economic losses to shrimp farmed in Brazil and Indonesia. Genetic manipulation of IMNV is difficult to perform due to the lack of IMNV full-length cDNA clone and unavailability of a shrimp cell line. This consequently hinders in vitro molecular studies of the virus infection. This study aims to construct full-length cDNA clones of IMNV and test for their infectivity in an insect cell line using reverse genetic methodologies. To construct the full length IMNV cDNA clones, genomic RNA of the virus was extracted from IMNV-infected shrimp and converted to cDNA before they were amplified by PCR using two primer pairs with overlapping sequences. The two amplified fragments were first cloned into pPrime cloning vector and used to transform competent DH5? E. coli cells. The transformed cells with recombinant IMNV-pPrime plasmids were selected and grown overnight to amplify the IMNV fragments in the plasmids before they were extracted, linearized and used as templates for PCR amplifications using another two primer pairs (infusion primers). The first infusion primer pair consists of a forward primer with sequence that is homologous to 15 bases of pFast Bac HT B vector at the intended cloning site and to the 5’end of IMNV genome sequence and the reverse primer with IMNV sequence that overlaps the 5’end of the 2nd fragment of the IMNV genome. The 2nd primer pair consists of a forward primer with sequence overlaps the reverse primer of the first fragment and a reverse primer with sequence identical to the 3’ end of IMNV genome and the 3’ end of the insertion site on the pFAST Bac HT B vector. The PCR products obtained were ligated with linearized pFast Bac HT B vector using the In-fusion? cloning kit (Clontech, USA) to generate recombinant pFastBac HT B- IMNV. These ligated products were then used to transform E. coli (Stellar?) competent cells. Cells with inserts were grown overnight and plasmid was extracted. To confirm if these plasmids contain correct insert, they were PCR amplified using 5 primer pairs, three of which are primers that target joining areas between IMNV and vector and between IMNV and IMNV. The clones with correct inserts were also cut with restriction enzymes and analyzed by agarose gel electrophoresis to confirm the size of the insert. The correct clones were then used as donor or transfer vectors to transform competent DH10 Bac cell which contains baculovirus genome (Bacmid) and a helper plasmid which assists the transposition of the inserted IMNV cDNA from the donor vector to the Bacmid DNA. Recombinant Bacmid-IMNV obtained was then used to transfect Sf9 cells and the transfected cells were observed daily for signs of pathology or abnormality. From this study, the transfected cells started to show signs of infection or cytopathic effects (CPE) which include cell division cessation, increases in cell sizes and death at day 4 after transfection. Culture supernatant of the transfected cells (supposedly containing IMNV and recombinant baculovirus) was used to inoculate na?ve Sf9 cells and the infected cell pathology were observed on day 2 p.i. and after. Immune-cytochemical study of the infected cells using antibody against IMNV nucleo-capsid protein revealed very strong immuno-positive reactions in both cytoplasm and nuclei of all infected cells. Using a transmission electron microscope (TEM), purified virus prepared from culture supernatant of infected cells was found to contain IMNV particles. Similar study on thin sections of infected Sf9 cells also revealed many baculovirus particles in the nuclei of all infected cells while few viral particles resemble IMNV particles were observed in one cytoplasmic vesicle. These results suggest that although the IMNV nucleocapsid were produced in relative large quantity as observed in infected cells by confocal microscopy, only small number of IMNV particles were successfully assembled in Sf9 cells.
ปีเริ่มต้นงานวิจัย: 2557-10-01
ปีสิ้นสุดงานวิจัย: 2559-09-30
ลิขสิทธิ์: แสดงที่มา-ไม่ใช้เพื่อการค้า-ไม่ดัดแปลง 3.0 ประเทศไทย (CC BY-NC-ND 3.0 TH)
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยมหิดล
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

ชุมพร สุวรรณยาน. "การสร้าง infectious clones ของไวรัส Infectious myonecrosis virus (IMNV) และการผลิตไวรัส IMNV ของกุ้ง ในเซลล์แมลงเพาะเลี้ยงโดยใช้ Baculovirus vector เป็นตัวช่วยBaculovirus mediated production of infectious myonecrosis virus (IMNV) infectious clones and IMNV of shrimp in insect and in cultured insect cells". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2559

ชุมพร สุวรรณยาน. "การสร้าง infectious clones ของไวรัส Infectious myonecrosis virus (IMNV) และการผลิตไวรัส IMNV ของกุ้ง ในเซลล์แมลงเพาะเลี้ยงโดยใช้ Baculovirus vector เป็นตัวช่วยBaculovirus mediated production of infectious myonecrosis virus (IMNV) infectious clones and IMNV of shrimp in insect and in cultured insect cells". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2559. Print.



TARR Wordcloud:
การสร้าง infectious clones ของไวรัส Infectious myonecrosis virus (IMNV) และการผลิตไวรัส IMNV ของกุ้ง ในเซลล์แมลงเพาะเลี้ยงโดยใช้ Baculovirus vector เป็นตัวช่วย
ชุมพร สุวรรณยาน
มหาวิทยาลัยมหิดล
30 กันยายน 2559
มันกุ้งจากหัวกุ้งขาว ( Litopenaeus vannamei): กิจกรรมการต้านออกซิเดชันและผลของการใช้เอนไซม์โปรตีเนสต่อผลผลิตและสมบัติบางประการ การศึกษารูปแบบการเลี้ยงกุ้งขาวแวนนาไมร่วมกับการเลี้ยงปลานิลและการปลูกข้าวในภาคตะวันออกเฉียงเหนือ การวิเคราะห์ต้นทุนและผลตอบแทนของฟาร์มเลี้ยงกุ้งขาวแวนนาไมที่ได้รับรองมาตรฐานการเลี้ยงสัตว์น้ำที่ดี (GAP) ในจังหวัดตรัง การจัดการทางโภชนาการสำหรับการอนุบาลและการเลี้ยงกุ้งขาวแวนนาไม แนวทางประเมินความเสี่ยงทางสิ่งแวดล้อมของสัตว์น้ำต่างถิ่น: กรณีศึกษาการนำเข้ากุ้งขาวแปซิฟิกเพื่อการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ.. โรคกุ้งคดงอในกุ้งขาว Litopenaeus vannamei การศึกษาเปรียบเทียบการผลิตการตลาดกุ้งขาวแวนนาไมแบบมีสัญญากับไม่มีสัญญา การวิเคราะห์ทางการเงินของการเลี้ยงกุ้งขาว (Litopenaeus vannamei) ในบ่อดิน: กรณีศึกษาคลองวาฬโมเดล การหาอัตราการหมุนเวียนนํ้าที่เหมาะสมในการเลี้ยงกุ้งขาวด้วยระบบนํ้าหมุนเวียน การพัฒนากระบวนการผลิตผลิตภัณฑ์มูลค่าเพิ่มจากเศษเหลืออุตสาหกรรมการแปรรูปกุ้งขาว

แสดงที่มา-ไม่ใช้เพื่อการค้า-ไม่ดัดแปลง 3.0 ประเทศไทย (CC BY-NC-ND 3.0 TH)
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair