สืบค้นงานวิจัย
การผลิตและศึกษาคุณสมบัติของรีคอมบิแนนต์แคปสิตโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ ซีโรทัยป์ 2 ในระบบของแบคทีเรีย E.coli
Prapapun Ong-ajchaowlerd - มหาวิทยาลัยมหิดล
ชื่อเรื่อง: การผลิตและศึกษาคุณสมบัติของรีคอมบิแนนต์แคปสิตโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ ซีโรทัยป์ 2 ในระบบของแบคทีเรีย E.coli
ชื่อเรื่อง (EN): Production and characterization of the recombinant capsid protein of dengue-2 virus in E.coli
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Prapapun Ong-ajchaowlerd
บทคัดย่อ: โรคไข้เลือดออก เป็นปัญหาทางสาธารณสุขที่สำคัญในประเทศเขตร้อนชื้น และก่อให้เกิดการเสียชีวิตในเด็กวัยเรียน สาเหตุของโรคนี้เกิดจากเชื้อไวรัสเด็งกี่ซึ่งจัดอยู่ในจีนัส Flavivirus มีสารพันธุกรรมชนิด RNA ที่ถูกห่อหุ้มด้วยโปรตีนแคปสิต รวมเรียกว่า นิวคลีโอแคปสิต ซึ่งจะถูกล้อมรอบด้วยโปรตีนโครงสร้างอีก 2 ชนิดที่อยู่บนผิวของอนุภาคไวรัส คือโปรตีน envelope และ โปรตีน prM/M โปรตีนส่วนโครงสร้างทั้งสองนี้สามารถกระตุ้นให้ระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายสร้างแอนติบอดีที่จำเพาะได้ ยกเว้นโปรตีนแคปสิต งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในการผลิตโปรตีนแคปสิต (หรือ โปรตีน C) ในรูปของรีคอมบิแนนต์โปรตีนจาก E.coli รวมถึงการศึกษาคุณสมบัติของโปรตีนในการกระตุ้นการสร้างแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อโปรตีนแคปสิตของไวรัสเด็งกี่ในหนู ผู้วิจัยได้ทำการเพิ่มจำนวนยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีน C ของเด็งกี่ไวรัสซีโรทัยป์ 2 โดยวิธี PCR และโคลนเข้าในเวคเตอร์ pMal-c2 ทำให้ได้พลาสมิด pMal/Capsid ขนาด 6.9 กิโลเบสในแบคทีเรีย E.coli และสามารถผลิตโปรตีนลูกผสม MBP-C ขนาด 60 กิโลดาลตันเมื่อมีการกระตุ้นด้วย IPTG โปรตีน MBP-C อยู่ในรูปที่ละลายน้ำได้เป็นส่วนใหญ่และแยกให้บริสุทธิ์ได้ด้วย amylose affinity chromatography ซึ่งมีผลผลิตประมาณ 8.3 มิลลิกรัมต่อการเลี้ยงเชื้อ 1 ลิตร จากการตรวจสอบคุณสมบัติของโปรตีน MBP-C โดยวิธี western blot analysis พบว่าโปรตีน MBP-C สามารถทำปฏิกิริยาได้ดีกับแอนติบอดีต่อโปรตีน MBP และ C โปรตีน MBP-C ถูกย่อยได้ด้วยเอ็นไซม์ Factor Xa protease ทำให้ได้เป็นโปรตีน MBP (ขนาด 45 กิโลดาลตัน) และโปรตีน C (ขนาด 15 กิโลดาลตัน) สภาวะที่เหมาะสมสำหรับการย่อยประกอบด้วย 1% (w/w) Factor Xa ที่อุณหภูมิ 23 หรือ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลาอย่างน้อย 3 ชั่วโมง จากการทดลองพบว่า pH ของการทำปฏิกิริยามีผลต่อประสิทธิภาพของการย่อย และความสามารถในการละลายของโปรตีน C ที่ได้หลังจากการย่อย ประสิทธิภาพของการย่อยที่ pH เป็นกลางหรือเป็นกรดจะให้ผลดีกว่า pH ที่เป็นเบส แต่โปรตีน C ที่ได้จากการย่อยจะเกิดการตกตะกอนที่ pH เป็นกลางหรือเป็นกรด และมีการละลายน้ำได้ดีขึ้นเมื่อมีการย่อยในสภาวะที่เป็นเบส ผลจากการแยกโปรตีนด้วย gel filtration chromatography พบว่าโปรตีน C ที่ละลายน้ำได้อยู่ในส่วนของ exclusion peak แสดงว่าโปรตีนน่าจะมีการเกาะกันเป็น aggregate ขนาดใหญ่ ส่วนโปรตีน C ในรูปตะกอนที่ได้หลังจากการย่อย MBP-C ที่ pH เป็นกลางได้ถูกนำมาฉีดหนู Balb/c เพื่อให้สร้างแอนติบอดี ผลการทดลองพบว่าซีรั่มหนูที่ถูกฉีดด้วยโปรตีน C มีแอนติบอดีที่ทำปฏิกิริยากับโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ซึ่งตรวจวัดได้โดยวิธี ELISA และมีความจำเพาะต่อโปรตีนรีคอมบิแนนต์ C จาก E.coli และโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่ซีโรทัยป์ 2 โดยวิธี western blot analysis นอกจากนี้ยังพบว่าการดูดซับแอนติบอดีในซีรั่มหนูด้วยโปรตีน MBP-C (ยกเว้นโปรตีน MBP) ก่อนนำมาทำปฏิกิริยา สามารถยับยั้งการเกิดปฏิกิริยาของซีรั่มหนูกับโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่ได้ แสดงว่าโปรตีนรีคอมบิแนนต์ C ที่ผลิตจาก E.coli มีคุณสมบัติในการกระตุ้นให้มีการสร้างแอนติบอดีที่จำเพาะและมีโครงสร้างเหมือนโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่ ซึ่งเหมาะจะนำไปใช้ในการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่
บทคัดย่อ (EN): C for at least 3 hrs. It was found that pH of the reaction affected both the cleavage efficiency and the solubility of the C protein. Cleavage efficiency was higher in neutral pH. The cleaved C protein became insoluble at acid or neutral pH, but remained soluble at basic pH. Soluble C protein formed large aggregates and appeared as a homogenous exclusion peak by gel filtration chromatography. Insoluble C protein obtained from MBP-C cleavage at neutral pH, was used to immunize two Balb/c mice. Specific anti-C antibody was detected by a solid phase ELISA using dengue 2 infected cell lysate as antigen. The antibody was reactive to both recombinant and native C proteins (dengue virus infected cell lysate) in western blot analysis. Reactivity to dengue C protein was abolished by pre-adsorption of mouse sera with the MBP-C, but not MBP proteins. These results indicate that the recombinant C protein produced in E.coli is immunogenic and contains native conformations. The protein could thus be used for production of anti-C monoclonal antibody.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://dcms.thailis.or.th/dcms/dccheck.php?Int_code=126&RecId=2389&obj_id=1265
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยมหิดล
คำสำคัญ (EN): Proteins
เจ้าของลิขสิทธิ์: มหาวิทยาลัยมหิดล
รายละเอียด: โรคไข้เลือดออก เป็นปัญหาทางสาธารณสุขที่สำคัญในประเทศเขตร้อนชื้น และก่อให้เกิดการเสียชีวิตในเด็กวัยเรียน สาเหตุของโรคนี้เกิดจากเชื้อไวรัสเด็งกี่ซึ่งจัดอยู่ในจีนัส Flavivirus มีสารพันธุกรรมชนิด RNA ที่ถูกห่อหุ้มด้วยโปรตีนแคปสิต รวมเรียกว่า นิวคลีโอแคปสิต ซึ่งจะถูกล้อมรอบด้วยโปรตีนโครงสร้างอีก 2 ชนิดที่อยู่บนผิวของอนุภาคไวรัส คือโปรตีน envelope และ โปรตีน prM/M โปรตีนส่วนโครงสร้างทั้งสองนี้สามารถกระตุ้นให้ระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายสร้างแอนติบอดีที่จำเพาะได้ ยกเว้นโปรตีนแคปสิต งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในการผลิตโปรตีนแคปสิต (หรือ โปรตีน C) ในรูปของรีคอมบิแนนต์โปรตีนจาก E.coli รวมถึงการศึกษาคุณสมบัติของโปรตีนในการกระตุ้นการสร้างแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อโปรตีนแคปสิตของไวรัสเด็งกี่ในหนู ผู้วิจัยได้ทำการเพิ่มจำนวนยีนที่ควบคุมการสร้างโปรตีน C ของเด็งกี่ไวรัสซีโรทัยป์ 2 โดยวิธี PCR และโคลนเข้าในเวคเตอร์ pMal-c2 ทำให้ได้พลาสมิด pMal/Capsid ขนาด 6.9 กิโลเบสในแบคทีเรีย E.coli และสามารถผลิตโปรตีนลูกผสม MBP-C ขนาด 60 กิโลดาลตันเมื่อมีการกระตุ้นด้วย IPTG โปรตีน MBP-C อยู่ในรูปที่ละลายน้ำได้เป็นส่วนใหญ่และแยกให้บริสุทธิ์ได้ด้วย amylose affinity chromatography ซึ่งมีผลผลิตประมาณ 8.3 มิลลิกรัมต่อการเลี้ยงเชื้อ 1 ลิตร จากการตรวจสอบคุณสมบัติของโปรตีน MBP-C โดยวิธี western blot analysis พบว่าโปรตีน MBP-C สามารถทำปฏิกิริยาได้ดีกับแอนติบอดีต่อโปรตีน MBP และ C โปรตีน MBP-C ถูกย่อยได้ด้วยเอ็นไซม์ Factor Xa protease ทำให้ได้เป็นโปรตีน MBP (ขนาด 45 กิโลดาลตัน) และโปรตีน C (ขนาด 15 กิโลดาลตัน) สภาวะที่เหมาะสมสำหรับการย่อยประกอบด้วย 1% (w/w) Factor Xa ที่อุณหภูมิ 23 หรือ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลาอย่างน้อย 3 ชั่วโมง จากการทดลองพบว่า pH ของการทำปฏิกิริยามีผลต่อประสิทธิภาพของการย่อย และความสามารถในการละลายของโปรตีน C ที่ได้หลังจากการย่อย ประสิทธิภาพของการย่อยที่ pH เป็นกลางหรือเป็นกรดจะให้ผลดีกว่า pH ที่เป็นเบส แต่โปรตีน C ที่ได้จากการย่อยจะเกิดการตกตะกอนที่ pH เป็นกลางหรือเป็นกรด และมีการละลายน้ำได้ดีขึ้นเมื่อมีการย่อยในสภาวะที่เป็นเบส ผลจากการแยกโปรตีนด้วย gel filtration chromatography พบว่าโปรตีน C ที่ละลายน้ำได้อยู่ในส่วนของ exclusion peak แสดงว่าโปรตีนน่าจะมีการเกาะกันเป็น aggregate ขนาดใหญ่ ส่วนโปรตีน C ในรูปตะกอนที่ได้หลังจากการย่อย MBP-C ที่ pH เป็นกลางได้ถูกนำมาฉีดหนู Balb/c เพื่อให้สร้างแอนติบอดี ผลการทดลองพบว่าซีรั่มหนูที่ถูกฉีดด้วยโปรตีน C มีแอนติบอดีที่ทำปฏิกิริยากับโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ซึ่งตรวจวัดได้โดยวิธี ELISA และมีความจำเพาะต่อโปรตีนรีคอมบิแนนต์ C จาก E.coli และโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่ซีโรทัยป์ 2 โดยวิธี western blot analysis นอกจากนี้ยังพบว่าการดูดซับแอนติบอดีในซีรั่มหนูด้วยโปรตีน MBP-C (ยกเว้นโปรตีน MBP) ก่อนนำมาทำปฏิกิริยา สามารถยับยั้งการเกิดปฏิกิริยาของซีรั่มหนูกับโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่ได้ แสดงว่าโปรตีนรีคอมบิแนนต์ C ที่ผลิตจาก E.coli มีคุณสมบัติในการกระตุ้นให้มีการสร้างแอนติบอดีที่จำเพาะและมีโครงสร้างเหมือนโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่ ซึ่งเหมาะจะนำไปใช้ในการผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีน C ของไวรัสเด็งกี่
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Prapapun Ong-ajchaowlerd. "การผลิตและศึกษาคุณสมบัติของรีคอมบิแนนต์แคปสิตโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ ซีโรทัยป์ 2 ในระบบของแบคทีเรีย E.coliProduction and characterization of the recombinant capsid protein of dengue-2 virus in E.coli". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2547

Prapapun Ong-ajchaowlerd. "การผลิตและศึกษาคุณสมบัติของรีคอมบิแนนต์แคปสิตโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ ซีโรทัยป์ 2 ในระบบของแบคทีเรีย E.coliProduction and characterization of the recombinant capsid protein of dengue-2 virus in E.coli". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2547. Print.



TARR Wordcloud:
การผลิตและศึกษาคุณสมบัติของรีคอมบิแนนต์แคปสิตโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ ซีโรทัยป์ 2 ในระบบของแบคทีเรีย E.coli
Prapapun Ong-ajchaowlerd
มหาวิทยาลัยมหิดล
2547
การผลิตและใช้รีคอมบิแนนท์โปรตีนเพื่อการตรวจวินิจฉัยโรคเลปโตสไปโรซีส การผลิตและคัดกรองไฮบริโดมาที่ผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อโปรตีนของไวรัสเด็งกี่ การเตรียมและการศึกษาเอกลักษณ์ของรีคอมบิแนนท์โปรตีน Plp B จากเชื้อ Pasteurella multocida A:1 ฤทธิ์ยับยั้งของแลกโตบาซิลลัสต่อแบคทีเรียในวงศ์เอนเทอโรแบคทีเรียซิอี สายพันธุ์ก่อโรคในระบบทางเดินปัสสาวะ ที่ผลิตเอนไซม์บีตา - การจำแนกโปรตีนตอบรับชนิดใหม่ต่อไวรัสเด็งกี่สายพันธุ์ที่ 2 บนผิวเซลล์เพาะเลี้ยงจากตับ ความสัมพันธ์ระหว่างคุณสมบัติน้ำเสียอุตสาหกรรมกับระบบการผลิตก๊าซชีวภาพ การสร้างและการศึกษาคุณสมบัติโปรตีนเพอริพลาสมิคแฟลกเจลลินของเชื้อ leptospira interrogans ซีโรวาร์ autumnal การปรับปรุงระบบต้นทุนการผลิตในโรงงานผลิตโคมไฟโดยใช้ระบบต้นทุนกิจกรรม การทำนายผลผลิตข้าวโดยใช้ระบบการอนุมานฟัซซีและซัพพอร์ตเวกเตอร์แมชีน สเตรปโตคอคคัสนิวโมนิอี : การกระจายของซีโรทัยป์, ความไวต่อยาต้านจุลชีพและการกลายพันธุ์ของยีนที่ทำให้เกิดการดื้อย
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair