สืบค้นงานวิจัย
การแสดงออกทางพันธุกรรมของโปรตีนติดตามเพื่อการประยุกต์ใช้ทางภูมิคุ้มกันวิทยาและการศึกษาทางชีววิทยาระดับโมเลกุล
Yaneenart Suwanwong - มหาวิทยาลัยมหิดล
ชื่อเรื่อง: การแสดงออกทางพันธุกรรมของโปรตีนติดตามเพื่อการประยุกต์ใช้ทางภูมิคุ้มกันวิทยาและการศึกษาทางชีววิทยาระดับโมเลกุล
ชื่อเรื่อง (EN): Genetic expression of tagging proteins for immunological application and biological studies
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Yaneenart Suwanwong
บทคัดย่อ: วิทยานิพนธ์ฉบับนี้นำเสนอการผลิตโปรตีนลูกผสมซึ่งมีคุณสมบัติในการจับกับแอนติบอดี และมีความสามารถในการเรืองแสง หรือทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ โดยใช้วิธีการทางพันธุวิศวกรรม ยีนควบคุมการสร้างโปรตีนลูกผสมประกอบด้วยโปรตีนซึ่งมีคุณสมบัติในการจับจำเพาะกับแอนติบอดี (z-domain) ทางปลายด้าน N หรือ C ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFPuv)ได้ถูกสร้างขึ้น และแสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli โปรตีนลูกผสมทั้งหมด (ZZGFP, GFPZ และ GFPZZ) สามารรถสกัดแยกให้บริสุทธิ์ โดยใช้คอลัมน์จับจำเพาะกับอิมมูโนกลอบูลิน จี (IgG) นอกจากนี้ โปรตีนลูกผสมซึ่งมีคุณสมบัติดังกล่าว พร้อมทั้งมีสายเปปไทด์ประกอบด้วยกรดอะมิโนฮิสทิดีน (H6GFPZ และ H6GFPZZ)ยังถูกสร้างขึ้นด้วย เพื่อช่วยในการสกัดแยกโปรตีนให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์จับจำเพาะซึ่งมีโลหะเป็นตัวกลาง และใช้ในการติดยึดโปรตีนเข้ากับพื้นผิวซึ่งมีโลหะเป็นตัวกลาง จากการศึกษาพบว่า โปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วย โปรตีนจับจำเพาะกับแอนติบอดีซึ่งต่อเข้าที่ปลายด้าน N ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ให้ปริมาณโปรตีนที่ทำหน้าที่อย่างสมบูรณ์ มากกว่าโปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วยโปรตีนจับจำเพาะกับแอนติบอดีซึ่งต่อเข้าที่ปลายด้าน C ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวถึง 10 เท่า การวิเคราะห์ความสามารถในการจับจำเพาะกับแอนติบอดีของโปรตีนลูกผสมที่สร้างขึ้น โดยใช้หลักการของ surface plasmon resonance พบว่า โปรตีนลูกผสม GFPZ, GFPZZ, H6GFPZ และ H6GFPZZ มีค่าคงที่ในการจับจำเพาะ (KA) กับ IgG = 6.7, 81.1, 2.4 และ 60.3 (x107 M-1) ตามลำดับ โปรตีนลูกผสมทั้งหมดได้ถูกนำไปประยุกต์ใช้ในการทดสอบทางภูมิคุ้มกันวิทยา เพื่อตรวจหาแอนติบอดีต่อเชื้อ Leptospira และ anti-nuclear antibody ผลที่ได้แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการจับกับแอนติบอดี และการเรืองแสง เทียบเท่ากับการใช้แอนติบอดีติดฉลากด้วยสารฟลูออเรสเซนต์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีนลูกผสมซึ่งประกอบด้วยโปรตีนที่ใช้ในการจับกับแอนติบอดีสองส่วน (GFPZZ และ H6GFPZZ) ให้การเรืองแสงมากกว่า โปรตีนซึ่งประกอบด้วยโปรตีนที่ใช้ในการจับกับแอนติบอดีเพียงส่วนเดียว (GFPZ และ H6GFPZ) ในขณะเดียวกัน โปรตีนลูกผสมประกอบด้วยโปรตีนซึ่งจับจำเพาะกับแอนติบอดี และฮีโมโกลบินจากแบคทีเรีย (VHb) ซึ่งสามารถทำหน้าที่แทนเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสได้ถูกสร้างขึ้น โปรตีนลูกผสม ZVHb และ ZZVHb มีค่าคงที่ในการจับจำเพาะ (KA) กับ IgG = 9.7 และ 49.1 (x 107 M-1) และทำการวัดค่า peroxidase activity ได้ 3.9 และ 1.5 units/mg ตามลำดับ ซึ่งเมื่อได้ทำการปรับสภาวะในการวัดให้เหมาะสมขึ้นแล้ว พบว่า สามารถตรวจวัดโปรตีนลูกผสมดังกล่าว ได้น้อยที่สุดถึง 250 ng ซึ่งมากกว่าเอนไซม์ horse-radish peroxidase เพียง 5 เท่า นอกจากนี้ บทบาทของโปรตีนลูกผสมเรืองแสงในทางชีววิทยายังได้ถูกศึกษา โดยใช้โปรตีนลูกผสมซึ่งมีความสามารถในการจับจำเพาะกับโลหะ และเรืองแสงสีเขียว ในการศึกษาผลของโปรตีนจับจำเพาะกับโลหะ ในการเคลื่อนที่ของโลหะภายในเซลล์แบคทีเรีย เซลล์ซึ่งแสดงออกโปรตีนจับจำเพาะต่อโลหะสังกะสีบนผิวเซลล์ ร่วมกับโปรตีนเรืองแสงสีเขียวภายในเซลล์ได้ถูกสร้างขึ้น เซลล์ดังกว่ามีความสามารถในการจับกับโลหะเพิ่มขึ้น 60 เท่าเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุม ความสามารถในการจับกับโลหะนี้มีผลกระทบต่อการนำโลหะเข้าสู่เซลล์ ดังจะเห็นได้จากการลดลงของการเรืองแสงของซึ่งแสดงออกโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ในขณะเดียวกัน การรักษาสมดุลของโลหะภายในเซลล์โดยการแสดงออกโปรตีนลูกผสมซึ่งมีความสามารถในการจับจำเพาะกับโลหะ และเรืองแสงสีเขียว ทำให้เซลล์เรืองแสงฟลูออเรสเซนต์เพิ่มมากขึ้น ผลการศึกษานี้ บ่งบอกถึงบทบาทของการจับกับโลหะของโปรตีนลูกผสม ต่อการการนำเข้าโลหะของเซลล์แบคทีเรีย การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพในนำโปรตีนลูกผสมไปประยุกต์ใช้ในด้านต่าง ๆ อาทิ การตรวจวินิจฉัยทางภูมิคุ้มกันวิทยา และการศึกษาปรากฏการณ์ในระดับเซลล์ เป็นต้น
บทคัดย่อ (EN): This thesis describes engineering of chimeric antibody-binding proteins possessing fluorescent or enzymatic activity as immunotaggers. The chimeric proteins were constructed by genetic in-frame fusion of genes encoding Fc-binding motif (Z-domain) to the green fluorescent protein (GFPuv) or Vitreoscilla hemoglobin (VHb). Five chimeric antibody-binding green fluorescent proteins were constructed by fusion of an Fc-binding motif to either N- or C- terminus of GFPuv. All chimeric proteins (ZZGFP, GFPZ, GFPZZ, H6GFPZ, and H6GFPZZ) were expressed in E. coli and were able to purified using IgG-Sepharose column. Two of five carried a hexa-histidine tag at the N-terminus to assist not only protein purification using IMAC but also protein immobilization on the solid support via metal coordination. Chimeric proteins containing GFP at the N-terminus provided 10 times higher yield than chimeric protein containing GFP at the C-terminus. The binding affinity of chimeric proteins toward immobilized IgG was determined by surface plasmon resonance (SPR) analysis resulting in KA = 6.7, 81.1, 2.4, and 60.3 (x107 M-1) for GFPZ, GFPZZ, H6GFPZ and H6GFPZZ, respectively. Chimeric antibody-binding green fluorescent proteins were applied in indirect immunofluorescent assay for detection of Leptospira antibodies and anti-nuclear antibodies. The results demonstrated a strong fluorescent signal of chimeric proteins comparable to that of the FITC-labeled antibody. Moreover, GFPZZ and H6GFPZZ provided more intense signals than GFPZ and H6GFPZ. In parallel, the chimeric Ab-binding VHbs providing peroxidase-like activity were constructed. The purified ZVHb and ZZVHb exhibited strong IgG-binding capacity up to KA = 9.7 and 49.1 (x 107 M-1) for ZVHb and ZZVHb, respectively. The peroxidase activity of ZVHb and ZZVHb was assayed to be 3.9 and 1.5 units/mg, respectively. More importantly, the detection limit obtained after maximization was at 250 ng, approximately 5-times higher than that of the horse-radish peroxidase. To gain further understanding of the role of chimeric GFPs in biological systems, the chimeric metal-binding GFP was used as an indicator to study the effect of a metal-binding motif on metal mobility in E. coli. Engineered cells co-expressing with a zinc-binding motif on the outer membrane and intracellular His6GFPuv were constucted. The engineered cells displayed 60 fold higher binding capability to zinc ions than those of the control cells. This high affinity was proven to influence the influx of metal ions into the cells in which a decline of fluorescent intensity of GFP could readily be detected. Meanwhile, balancing of metal homeostasis due to the presence of cytoplasmic His6GFP enhanced the fluorescent emission. This implies the significant role of an intracellular chelating effect by chimeric protein on metal intaking of bacterial cells. All these findings support the high potential of using the chimeric proteins in various kinds of application such as immunodiagnosis and cell event study
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://dcms.thailis.or.th/dcms/dccheck.php?Int_code=126&RecId=3602&obj_id=5063
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยมหิดล
คำสำคัญ (EN): Vitreoscilla
เจ้าของลิขสิทธิ์: มหาวิทยาลัยมหิดล
รายละเอียด: วิทยานิพนธ์ฉบับนี้นำเสนอการผลิตโปรตีนลูกผสมซึ่งมีคุณสมบัติในการจับกับแอนติบอดี และมีความสามารถในการเรืองแสง หรือทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ โดยใช้วิธีการทางพันธุวิศวกรรม ยีนควบคุมการสร้างโปรตีนลูกผสมประกอบด้วยโปรตีนซึ่งมีคุณสมบัติในการจับจำเพาะกับแอนติบอดี (z-domain) ทางปลายด้าน N หรือ C ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFPuv)ได้ถูกสร้างขึ้น และแสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli โปรตีนลูกผสมทั้งหมด (ZZGFP, GFPZ และ GFPZZ) สามารรถสกัดแยกให้บริสุทธิ์ โดยใช้คอลัมน์จับจำเพาะกับอิมมูโนกลอบูลิน จี (IgG) นอกจากนี้ โปรตีนลูกผสมซึ่งมีคุณสมบัติดังกล่าว พร้อมทั้งมีสายเปปไทด์ประกอบด้วยกรดอะมิโนฮิสทิดีน (H6GFPZ และ H6GFPZZ)ยังถูกสร้างขึ้นด้วย เพื่อช่วยในการสกัดแยกโปรตีนให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์จับจำเพาะซึ่งมีโลหะเป็นตัวกลาง และใช้ในการติดยึดโปรตีนเข้ากับพื้นผิวซึ่งมีโลหะเป็นตัวกลาง จากการศึกษาพบว่า โปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วย โปรตีนจับจำเพาะกับแอนติบอดีซึ่งต่อเข้าที่ปลายด้าน N ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ให้ปริมาณโปรตีนที่ทำหน้าที่อย่างสมบูรณ์ มากกว่าโปรตีนลูกผสมที่ประกอบด้วยโปรตีนจับจำเพาะกับแอนติบอดีซึ่งต่อเข้าที่ปลายด้าน C ของโปรตีนเรืองแสงสีเขียวถึง 10 เท่า การวิเคราะห์ความสามารถในการจับจำเพาะกับแอนติบอดีของโปรตีนลูกผสมที่สร้างขึ้น โดยใช้หลักการของ surface plasmon resonance พบว่า โปรตีนลูกผสม GFPZ, GFPZZ, H6GFPZ และ H6GFPZZ มีค่าคงที่ในการจับจำเพาะ (KA) กับ IgG = 6.7, 81.1, 2.4 และ 60.3 (x107 M-1) ตามลำดับ โปรตีนลูกผสมทั้งหมดได้ถูกนำไปประยุกต์ใช้ในการทดสอบทางภูมิคุ้มกันวิทยา เพื่อตรวจหาแอนติบอดีต่อเชื้อ Leptospira และ anti-nuclear antibody ผลที่ได้แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการจับกับแอนติบอดี และการเรืองแสง เทียบเท่ากับการใช้แอนติบอดีติดฉลากด้วยสารฟลูออเรสเซนต์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งโปรตีนลูกผสมซึ่งประกอบด้วยโปรตีนที่ใช้ในการจับกับแอนติบอดีสองส่วน (GFPZZ และ H6GFPZZ) ให้การเรืองแสงมากกว่า โปรตีนซึ่งประกอบด้วยโปรตีนที่ใช้ในการจับกับแอนติบอดีเพียงส่วนเดียว (GFPZ และ H6GFPZ) ในขณะเดียวกัน โปรตีนลูกผสมประกอบด้วยโปรตีนซึ่งจับจำเพาะกับแอนติบอดี และฮีโมโกลบินจากแบคทีเรีย (VHb) ซึ่งสามารถทำหน้าที่แทนเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสได้ถูกสร้างขึ้น โปรตีนลูกผสม ZVHb และ ZZVHb มีค่าคงที่ในการจับจำเพาะ (KA) กับ IgG = 9.7 และ 49.1 (x 107 M-1) และทำการวัดค่า peroxidase activity ได้ 3.9 และ 1.5 units/mg ตามลำดับ ซึ่งเมื่อได้ทำการปรับสภาวะในการวัดให้เหมาะสมขึ้นแล้ว พบว่า สามารถตรวจวัดโปรตีนลูกผสมดังกล่าว ได้น้อยที่สุดถึง 250 ng ซึ่งมากกว่าเอนไซม์ horse-radish peroxidase เพียง 5 เท่า นอกจากนี้ บทบาทของโปรตีนลูกผสมเรืองแสงในทางชีววิทยายังได้ถูกศึกษา โดยใช้โปรตีนลูกผสมซึ่งมีความสามารถในการจับจำเพาะกับโลหะ และเรืองแสงสีเขียว ในการศึกษาผลของโปรตีนจับจำเพาะกับโลหะ ในการเคลื่อนที่ของโลหะภายในเซลล์แบคทีเรีย เซลล์ซึ่งแสดงออกโปรตีนจับจำเพาะต่อโลหะสังกะสีบนผิวเซลล์ ร่วมกับโปรตีนเรืองแสงสีเขียวภายในเซลล์ได้ถูกสร้างขึ้น เซลล์ดังกว่ามีความสามารถในการจับกับโลหะเพิ่มขึ้น 60 เท่าเมื่อเทียบกับเซลล์ควบคุม ความสามารถในการจับกับโลหะนี้มีผลกระทบต่อการนำโลหะเข้าสู่เซลล์ ดังจะเห็นได้จากการลดลงของการเรืองแสงของซึ่งแสดงออกโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ในขณะเดียวกัน การรักษาสมดุลของโลหะภายในเซลล์โดยการแสดงออกโปรตีนลูกผสมซึ่งมีความสามารถในการจับจำเพาะกับโลหะ และเรืองแสงสีเขียว ทำให้เซลล์เรืองแสงฟลูออเรสเซนต์เพิ่มมากขึ้น ผลการศึกษานี้ บ่งบอกถึงบทบาทของการจับกับโลหะของโปรตีนลูกผสม ต่อการการนำเข้าโลหะของเซลล์แบคทีเรีย การศึกษาครั้งนี้แสดงให้เห็นถึงศักยภาพในนำโปรตีนลูกผสมไปประยุกต์ใช้ในด้านต่าง ๆ อาทิ การตรวจวินิจฉัยทางภูมิคุ้มกันวิทยา และการศึกษาปรากฏการณ์ในระดับเซลล์ เป็นต้น
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Yaneenart Suwanwong. "การแสดงออกทางพันธุกรรมของโปรตีนติดตามเพื่อการประยุกต์ใช้ทางภูมิคุ้มกันวิทยาและการศึกษาทางชีววิทยาระดับโมเลกุลGenetic expression of tagging proteins for immunological application and biological studies". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2549

Yaneenart Suwanwong. "การแสดงออกทางพันธุกรรมของโปรตีนติดตามเพื่อการประยุกต์ใช้ทางภูมิคุ้มกันวิทยาและการศึกษาทางชีววิทยาระดับโมเลกุลGenetic expression of tagging proteins for immunological application and biological studies". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2549. Print.



TARR Wordcloud:
การแสดงออกทางพันธุกรรมของโปรตีนติดตามเพื่อการประยุกต์ใช้ทางภูมิคุ้มกันวิทยาและการศึกษาทางชีววิทยาระดับโมเลกุล
Yaneenart Suwanwong
มหาวิทยาลัยมหิดล
2549
การผลิตผงโปรตีนเข้มข้นจากแมงกะพรุน และการประยุกต์ใช้ การพัฒนาเครื่องหมายพันธุกรรม AFLP เพื่อประยุกต์ใช้ในการสร้างแผนที่พันธุกรรมของกุ้งกุลาดำ การศึกษาทางพันธุศาสตร์โมเลกุลของโปรตีนที่แสดงออกในช่วงการพัฒนาของหัวมันสำปะหลัง การย่อยสลายโพลีเมอร์ที่มีโมเลกุลเชื่อมโยงที่ได้จากผลิตภัณฑ์ยาง เหลือใช้และการประยุกต์ใช้ การศึกษาทางพันธุศาสตร์โมเลกุลและการแสดงออกของยีนโปรตีนขนส่งน้ำตาลซูโครสในมันสำปะหลัง การศึกษาเสถียรภาพในระดับโมเลกุลที่บริเวณอนุรักษ์ของโปรตีนฆ่าลูกน้ำยุงชนิด Cry4B การศึกษาคุณลักษณะการดื้อยาในระดับโมเลกุลและความหลากหลายทาง การศึกษาคุณสมบัติระดับโมเลกุลของโปรตีนเฉพาะส่วนที่ทำให้เกิดรูรั่วบนผิวเซลล์ของโปรตีนสารพิษ Adenylate cyclase-haemolysin จากเชื้อ Bordetel การโคลนยีนการแสดงออกและคุณสมบัติทางชีววิทยาของโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งไรโบโซมประเภทที่ ผลของเอสโตรเจนต่อการแสดงออกของโปรตีน Arc ในการเพิ่มความจำ
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair