| บทคัดย่อ: |
ีหลักฐานจากต ารายาจีนโบราณและความเชื่อโดยทั่วไปว่าสารสกัดจากปลิงทะเลมีคุณค่าทั้งในทางเภสัชวิทยาและการเป็นอาหารเสริม
เช่นสามารถระงับความเจ็บปวดในช่องท้อง ช่วยในการสมานแผลทั้งที่ผิวหนังและแผลภายใน เป็นยาอายุวัฒนะ ปูองกันความจ าเสื่อม เสริมสร้าง
สมรรถภาพทางเพศ ตลอดจนปูองกันมะเร็งได้ เนื่องมาจากการที่ปลิงทะเลเป็นสัตว์ที่มีสารต้านอนุมูลอิสระ(antioxidant)และต้านการอักเสบ
(anti-inflammatory) สูงและมีความสามารถสูงในการซ่อมแซมเนื้อเยื่อของตนเอง (regeneration) โครงการนี้เราจึงเสนอที่จะตรวจสอบการออก
ฤทธิ์ของสารสกัดจากปลิงทะเลขาว H. scabra ทั้งในส่วนที่สกัดโดยสารบับเฟอร์ซึ่งประกอบด้วยโปรตีนและส่วนที่สกัดด้วยตัวท าละลายอินทรีย์
(hexane, ethyl acetate, butanol และ ethanol) ซึ่งประกอบด้วยสารในกลุ่ม secondary metabotites ในการสมานแผล (wound healing)
การต้านอนุมูลอิสระ (antioxidation) การต้านหรือชะลอความแก่ (antiaging) การต้านโรค Parkinson โรค Alzheimer และการกระตุ้น neural
stem cells และการต่อต้านมะเร็ง (anticancer) นอกจากนั้นแล้วก็จะตรวจดูความสามารถในการเป็นอาหารเสริม เช่นปริมาณโปรตีนและไขมัน
โดยเฉพาะ กรดอะมิโนและกรดไขมันที่จ าเป็นต่อร่างกาย
เราได้ท าการสกัดและวิเคราะห์สารจากทั้งตัว (whole body-WB) ส่วนผนังล าตัว (body wall-BW) ส่วนอวัยวะภายใน (viscera-VI)
การวิเคราะห์สารประเภทโปรตีน (protein-P) จากปลิงทะเลด้วยวิธี Western blot พบโปรตีนในกลุ่ม collagen (collagen type I, III) ซึ่งเป็น
โปรตีนหลักในผนังล าตัวของปลิง (body wall) การพบ collagen ทั้ง 2 ชนิดเป็นโปรตีนหลักของผนังล าตัวสอดคล้องกับจุลกายวิภาคของผนัง
ล าตัว ซึ่งมีลักษณะเป็นชั้นหนาประกอบด้วยใยของ collagen ที่รวมตัวเป็นมัดขนาดใหญ่ซึ่งน่าจะเป็น collagen I โยงติดกันด้วยใย collagen
บางๆ คล้าย reticular fibers ซึ่งน่าจะเป็น collagen III พบโปรตีน actin จากชั้นกล้ามเนื้อ ซึ่งเป็นชั้นบางๆ อยู่ใต้ชั้น collagen เรายังพบโปรตีน
ในกลุ่ม growth factors ใน FGF family โดยเฉพาะ EGF และ NGF ซึ่งเป็นโปรตีนที่น่าจะมีลักษณะอนุรักษ์คล้ายกับโปรตีนชนิดเดียวกันในมนุษย์
โปรตีนจากปลิงดังกล่าวอาจมีการออกฤทธิ์ในการกระตุ้นการสมานแผลและเซลล์ต้นก าเนิดของมนุษย์ได้ การสกัดและวิเคราะห์สารในกลุ่ม
secondary metabolites ท าโดยใช้ acetone-methanol แล้วจึงสกัดแยกสารต่อไปโดยใช้ solvent ทีมีขั้วแตกต่างกันจากน้อยไปหามาก ได้แก่
การสกัดด้วย hexane (HE), ethyl acetate (EA), butanol (BU) และ ethanol (ET) อย่างเดียว ซึ่งจะได้ส่วน (fraction) ของสารที่มีขั้วเพิ่มขึ้น
เรื่อยๆตามลักษณะการละลายใน solvent นั้นๆ จากการวิเคราะห์ด้วยวิธี 1
H NMR LC-MS ส่วนสกัดชั้น hexane มีสารกลุ่มของ long chain
fatty acid สารกลุ่ม steroids และ small terpenes สารสกัดชั้น ethyl acetate,n-butanol มีสารพวก triterpene glycosides,
thromboxanes-prostanoids, sterol-fatty acids, และ polyphenol ส่วนการสกัดด้วย ethanol (ET) ก็ใด้สารพวก triterpene glycosides,
thromboxanes-prostanoids และ polyphenol เช่นเดียวกันแต่อาจมีชนิดของสารต่างกัน
เราได้ท าการวิเคราะห์คุณสมบัติในการเป็นอาหารเสริมของสารสกัดจากปลิงทะเลขาวและพบว่าเนื้อปลิงทะเล มีสารที่มีคุณค่าเป็นสาร
เสริมอาหารที่ส าคัญหลายชนิด รวมทั้งกรดไขมันที่มีความส าคัญต่อการพัฒนาและการท างานของระบบอวัยวะต่างๆของร่างกาย โดยเฉพาะระบบ
ประสาท เช่นกรด oleic, nervonic, linoleic, linolenic, arachidonic และ eicosapentanoic นอกจากนั้นแล้วเนื้อของปลิงทะเลขาวมีโปรตีน
สูงโดยเฉพาะคอลลาเจนในสัดส่วนที่สูงมาก กรดอะมิโนที่เป็นองค์ประกอบของคอลลาเจน (glycine, proline, hydroxyproline) และกรดอะมิโน
ที่จ าเป็นต่อชีวิต (essential amino acids) ก็มีระดับสูงเช่นเดียวกัน นอกจากนั้นยังมีกรดอะมิโน glutamic acid สูงมากทั้งในส่วนที่เป็น
องค์ประกอบของโปรตีนและส่วนที่เป็นกรดอะมิโนอิสระ ซึ่งน่าจะเกี่ยวกับการกระตุ้นการท างานของระบบประสาท แต่ในกลุ่มสารวิตามินและสาร
สื่อประสาทปรากฏว่าปลิงทะเลไม่มีวิตามินเอ แต่มีวิตามินซีและสารกาบาอยู่ในระดับต่ า ขณะที่วิตามินอีมีสูงกว่าในปลา โดยรวมนับได้ว่าเนื้อ
ปลิงทะเลขาวมีสารเสริมอาหารหลายชนิดที่มีประโยชน์ในเชิงโภชนาการต่อการพัฒนาและการท างานของร่างกายมนุษย์
เราได้ศึกษาผลของสารสกัดจากปลิงทะเลในการสมานแผล โดยใช้วิธีทดสอบแบบระบบหลอดทดลอง ( in vitro) ทดสอบการต้าน
กระบวนการอักเสบ ในเซลล์ macrophages ที่กระตุ้นโดย bacterial lipopolysaccharide (LPS) โดยการวัดการผลิต NO และสารไซโตคลายส์
(cytokines) ได้แก่ IL1β, IL6
, TNFα, TGFβ2 ซึ่งเป็น proinflammatory cytokines และ IL10 กับ TGFβ3 ซึ่งเป็น anti-inflammatory cytokines
พบว่าสารสกัดจากปลิงทะเลส่วน VIP, BWEA, BWET, WBEA มีความสามารถในการต้านการอักเสบได้ดีและสามารถกระตุ้นการเพิ่มจ านวนและ
การเคลื่อนตัวเพื่อสมานรอยแผลของเซลล์ keratinocytes และ fibroblasts ได้ด้วย การทดสอบแบบ in vivo ในหนู rat ปกติและในหนู rat ที่ถูก
กระตุ้นให้เกิดเบาหวานด้วย streptozotocin ปรากฏว่า สารสกัดที่มีความสามารถในการกระตุ้นการสมานแผลได้ดีที่สุดคือ secondary
metabolites ในส่วน VIEA, BWEA, BWBU, VIBU
การทดสอบการออกฤทธิ์ของสารสกัดส่วนต่างๆในการต้านอนุมูลอิสระ (antioxidant activities) ด้วยวิธีDPPH พบว่าสารสกัดที่ออก
ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระที่ดีที่สุดคือ secondary metabolites จาก BWET, WBBU แต่เมือทดสอบด้วยวิธีABTS พบว่าสารสกัดที่ออกฤทธิ์ต้านอนุมูล
อิสระที่ดีที่สุดคือ WBHE, BWHE
การต้านการสลายของเซลล์ประสาทจากโรค Parkinson โดยใช้ human neuroblastoma SH-SY5Y cells เป็นต้นแบบพบว่าสาร
สกัดส่วน BWEA, BWET, WBEA, WBBU สามารถลดความเป็นพิษและปูองกันการตายของเซลล์จากการได้รับสาร MPP+ การทดสอบ
ประสิทธิภาพของสารสกัดจากปลิงทะเลขาวในการต้านการสลายของเซลล์ประสาทจากโรค Parkinson โดยใช้หนอน C. elegans เป็นต้นแบบ
พบว่าสารสกัด BWEA, WBEA, BWET, WBBU มีความสามารถในการฟื้นฟู dopaminergic neuron ที่ถูกท าลายด้วย 6-OHDA ลดการสะสม
โปรตีนแอลฟา-ซินนิวคลีอิน และเพิ่มปริมาณไขมันรวมได้ดีที่สุด การทดสอบในหนูสายพันธ์ C57BL/6 ที่ได้รับสาร MPTP ยังพบว่า BWET สามารถ
ลดอาการของโรค Parkinson ได้
การปูองกันการสลายตัวของเซลล์ประสาทและการออกฤทธิ์ต้านโรค Alzheimer โดยใช้ mouse hippocampal cell (HT-22) เป็น
ต้นแบบ พบว่า สารสกัด BWEA, BWBU, BWET, WBEA, WBBU มีประสิทธิภาพในการลดอัตราการตายของเซลล์ HT-22 จากการกระตุ้นด้วย glutamate โดยลดการเกิด DNA condensation DNA fragmentation และลดปริมาณ Ca2+ influx ทั้งในกลุ่ม Pre-treatment และ Cotreatment สารสกัดดังกล่าวยังมีประสิทธิภาพในการลดการสะสมของโปรตีนเบต้าอะไมลอดยด์(beta-amyloid) และลดอัตราการตายของเซลล์
N2a/APP and N2a/SWE ได้อีกด้วย เมื่อใช้หนอน C. elegans เป็นต้นแบบ พบว่าสารสกัดดังกล่าวมีความสามารถลดอาการ muscle paralysis
จากการสะสมของโปรตีนเบต้าอะไมลอดย์ การทดสอบในหนูสายพันธุ์ ICR ที่ถูกมัดหลอดเลือด common carotid artery ยังพบว่าสารสกัด
BWBU สามารถลดอาการความจ าเสือมจากโรค vascular dementiaได้
สารสกัดโปรตีนสกัดจาก radial nerve, viscera และ body wall ที่ความเข้มข้นต่ า (0.1-1 µg/ml) สามารถกระตุ้นให้
Mesenchymal stem cells แบ่งตัวได้มากกว่ากลุ่มควบคุมและไม่เป็นพิษต่อเซลล์ อีกทั้งสามารถกระตุ้นให้ Mesenchymal stem cells
สามารถแปลี่ยนสภาพ (differentiate) ไปเป็น neural stem cell ได้ดีและเพิ่มจ านวนมากขึ้น
การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดในการการชะลอความแก่ (anti-aging activity) โดยใช้หนอน C. elegans เป็นต้นแบบ ปรากฏ
ว่าสารสกัดที่มีความสามารถในการชะลอความแก่โดยการยืดอายุของหนอนได้ดีที่สุด คือ BWEA, WBBU นอกจากนั้นเรายังพบว่าสารสกัดจาก
ปลิงทะเลขาวทั้ง 2 ส่วนช่วยให้หนอน C. elegans ทนต่อการได้รับสาร paraquat ซึ่งเป็นยาฆ่าวัชพืชที่ท าให้เกิด oxidative stress และโรค
Parkinson ได้ดีกว่ากลุ่มควบคุม
เราได้ท าการทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดจากปลิงทะเลขาวและพบว่าส่วน BWEA และ BWET สามารถฆ่าโดยชักน าให้เกิดการ
ตายแบบ apoptosis และระงับการแพร่กระจายของเซลล์มะเร็ง 3 ชนิด ได้แก่ เซลล์มะเร็งที่เกิดจากเซลล์ประสาทพี่เลี้ยง (Glioma-A172 และ
U87MG glioma cell lines) เซลล์มะเร็งเต้านม (Brest cancer cell-MDA MB-231 cell line) และเซลล์มะเร็งต่อมลูกหมาก (Prostate cancer
cell- LNCaP, PC3 cell lines) |
| บทคัดย่อ (EN): |
It is claimed in the Traditional Chinese Medicine and from the general beliefs among Asian people that in addition
to providing a rich nourishment for human body the sea cucumber products can also confer important health benefits to
the consumers, including suppression of skin and visceral pain, accelerated wound healing, general elixirs that help to
maintain reproductive health, prevent dementia and increase longevity. It is believed that these qualities are possible
because sea cumbers contain antioxidants that allow them to withstand UV irradiation in their sun–exposed living habitat,
some weak toxins that can act as anti-inflammatory substances, and the exemplary ability to regenerate damaged or lost
body parts unequal amongst members of the animal phyla. Therefore, in this research project we proposed to investigate
the pharmacological effects and nutraceutical benefits of the extracts from the tropical sea cucumber, Holothuria scabra,
including proteins and secondary metabolites,on wound healing, antioxidation, antineurodegeration from Parkinson and
Alzheimers, promotion of neural stem cells, antiaging and anticancer, using rigorous bioassays. We also examine the
nutraceutical benefits of the sea cucumber products.
We have extracted proteins (P) and secondary metabolites from the whole body (WB), body wall (BW) and vicera
(VI) by using lysis buffer for proteins and sequential solvent partioning including hexane (HE), ethyl acetate (EA), butanol
(BU). The samples were also extracted by ethanol (ET), a more acceptable way for preparing consumer products. Before
testing the bioactivities we have identified the chemical constituents of each fraction. Using Western blot we have
identified collagen I and III as the major structural proteins followed by actin which are correlated with the thick fibrous
body wall and thin underlining muscle of the sea cucumber. There were also growth factors including EGF and NGF-like
peptides which may account for the high regenerative power of the animal. Secondary metabolites in solvent fractions
were analysed by NMR and LC-MS spectroscopy, and it was found that HE fraction contained mainly long chain fatty acids,
steroids and small terpenes while EA and BU fractions contained large triterpene glycosides, thromboxanes-prostanoids,
sterol-fatty acids, and polyphenols. Extraction with ET yielded the same groups of compounds as the EA and BU extractions
but with a few different members of the same families.
We have investigated the nutraceutical compositions of the sea cucumber and found it to be rich in certain
essential long chain fatty acids, including oleic, nervonic, linoleic, linolenic, arachidonic, and eicosapentanoic acids. The sea
cucumber is also rich in bound and free amino acids, especially glycine, proline, hydroproline, other essential amino acids,
and especially a very high amount of glutamic acid. The sea cucumber also has a high content of vitamin E but not A and
C.
We have investigated the ability of sea cucumber extracts in wound healing process in vitro and found that VIP,
BWEA, BWET, WBEA fractions could inhibit the production of NO and anti-inflammatory cytokines including IL1β, IL6
, TNFα,
TGFβ2 by LPS-induced macrophages, while increasing the production of proinflammatory cytokines including IL10 and TGFβ3
.
These fractions could also stimulate the proliferation and migration of keratinocytes and fibroblasts to fill the gaps created
in the wound-scratch assay. When tested in normal as well in streptozotocin-indiced diabetic rats the wound healing was
best achieved by BWEA, BWBU, VIEA, VIBU fractions.
The fractions which showed the best antioxidation activity as tested by DPPH assay were BWET, WBBU, and as
tested by ABTS assay were WBHE, BWHE.
When testing for anti-Parkinson activity using human neuroblastoma SH-SY5Y cells as a model it was found that
BWEA, BWET, WBEA, WBBU fractions could prevent MPP+ induced apoptotic cell death.When tested in C.elegans BWEA,
WBEA, BWET, WBBU fractions could protect and enhance the recovery of dopaminergic neurons from being damaged by 6-
OHDA treatment. The fractions also reduced the expression of alpha-synuclein deposit in muscle cells and increased total
lipid content which was previously suppressed by alpha-synuclein accumulation. BWET fraction could also help the MPTPinduced Parkinson C57BL/6 mice to recover their memories and damaged neurons in the brain.
In testing for anti-Alzheimers activity using mouse hippocampal cell (HT-22) as a model, it was founded that
BWEA, BWBU, BWET, WBEA, WBBU fractions could prevent the glutamate-induced cell death and calcium influx in both preand co-treatments. These fractions could also reduce beta amyloid aggregation in N2a/APP and N2a/SWE cells which are
the accepted cellular models for testing anti-Alzeimers activity. Similarly, when tested in C.elegans these fractions could
also reduce beta amyloid accumulation in muscle cells and protected the worms from paralysis. The BWBU could also
assist rats with induced vascular dementia in recovering their memories and prevent neuronal death in hippocampus. Protein extracts from radial nerve, viscera and body wall at low concentrations not exceeding 0.1-1 µg/ml, could
stimulate the proliferation of mesenchymal stem cells as well as the proliferation and branching of MSC-derived neural
stem cells.
In testing for antiaging activity using C.elegans as a model, it was found that BWEA and WBBU fractions have the
best efficiency in lengthening the lifespan of the worms. These fractions also helped the worms from being succumbed to
heat and oxidative stress by paraquat, a widely used weed killer that causes Parkinsonism.
In testing for anti-cancer activities, BWEA and BWET fractions could induce apoptotic cell death and reduce
metastatic ability of Glioma cells (A172 and U87MG glioma cell lines), breast cancer cells (MDA MB-231 cell line) and
prostate cancer cells (LNCaP,PC3 cell lines).
It is recommended that sea cucumber products for human health and diseases can be developed from the
extracts of body wall, viscera and even whole body by ethanol, ethyl acetate or butanol. |
