สืบค้นงานวิจัย
เอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส จาก Pseudomonas stutzeri ST-201: การโคลนยีน การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์แล
Choedchai Saehuan - มหาวิทยาลัยมหิดล
ชื่อเรื่อง: เอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส จาก Pseudomonas stutzeri ST-201: การโคลนยีน การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์แล
ชื่อเรื่อง (EN): Benzoylformate decarboxylase from Psyeudomonas stutzeri ST-201: gene cloning, enzyme characterization and role in d-phenylglygine degradation
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Choedchai Saehuan
บทคัดย่อ: การศึกษานี้รายงานบทบาทของเอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส (PsBFDC) ใน Pseudomonas stutzeri ST-201 ในการย่อยสลายดี-ฟินิลกลัยซีน รวมถึงการโคลนยีน การทำให้ยีนแสดงออก การ ทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ และการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ โดยพบว่า P. stutzeri ST-201 สร้างเอนไซม์ดี-ฟินิล กลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรส และตามด้วย PsBFDC ในเวลาต่อมาเมื่อถูกชักนำด้วยดี-ฟินิลกลัยซีน แต่เแบคทีเรีย ชนิดนี้สร้างเพียง PsBFDC เท่านั้นเมื่อถูกชักนำด้วยเบนโซอิลฟอร์เมต ผลที่ได้แสดงให้เห็นว่า PsBFDC มีบทบาท ในขั้นตอนต่อจากการย่อยสลายดี-ฟินิลกลัยซีน เมื่อแยก PsBFDC จาก P. stutzeri ST-201 และทำให้บริสุทธิ์แล้ว นำไปหาลำดับของกรดอะมิโนด้านปลาย N เพื่อใช้ออกแบบ probe สำหรับทำ hybridization ในการโคลนยีน ได้ ชิ้นดีเอนเอที่มี open reading frame ให้ชื่อว่า dpgB เป็นรหัสสำหรับเอนไซม์ PsBFDC ซึ่งเมื่อทำ sequence alignment พบว่ามีความคล้ายคลึงกับยีนในกลุ่ม thiamin-diphosphate dependent enzymes ยีน dpgB นี้ ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 1,581 คู่เบส และสร้างโพลีเปปไทด์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 526 ตัว เมื่อนำยีนนี้ซึ่ง โคลนอยู่ในเวกเตอร์ pET17b ไปทำให้เกิดแสดงออกใน Escherichia coli BL21 (DE3) แล้วนำเอนไซม์ที่ได้ไป ผ่านกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ซึ่งประกอบด้วยการตกตะกอนโปรตีนด้วย ammonium sulfate ต่อด้วย Phenyl Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography, ultrafiltration และ Q-Sepharose FF anion-exchange chromatography ในที่สุดได้เอนไซม์บริสุทธิ์ที่มี specific activity เท่ากับ 243 U mg-1 น้ำหนักโมเลกุลของ native PsBFDC มีค่าประมาณ 224 kDa และหน่วยย่อยของเอนไซม์มีน้ำหนัก 56 kDa นั่นคือเอนไซม์ชนิดนี้ประกอบด้วย หน่วยย่อยที่เหมือนกัน 4 หน่วย เอนไซม์มี isoelectric point (pI) ที่ 5.2 ทำงานได้ดีที่สุดในช่วง 35-50 oC pH 6.0 ค่า Km สำหรับเบนโซอิลฟอร์เมตคือ 0.69 mM และค่า kcat คือ 222 s-1 การศึกษาครั้งนี้ยังสามารถโคลนยีนสำหรับ NAD+/NADP+-dependent benzaldehyde dehydrogenase จาก P. stutzeri ST-201(PsBADH) ซึ่งให้ชื่อว่ายีน dpgC และทำให้เกิดการแสดงออกของยีนได้ เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์ในวิถีการย่อยสลายแมนดีเลต พบว่าทั้งเอนไซม์ PsBFDC และ PsBADH มีความคล้ายคลึงทั้งในแง่ลำดับกรดอะมิโน (มากกว่า 85% identity) และคุณสมบัติทาง จลนศาสตร์กับ homologous enzymes ที่พบใน P. putida ATCC 12633 อย่างไรก็ตามเนื่องจาก P. stutzeri ST-201 ไม่สามารถเจริญเติบโตได้โดยใช้แมนดีเลต อีกทั้งยีน dpgB ก็มิได้เป็นส่วนหนึ่งของโอเปอรอน ดังนั้นเอนไซม์ PsBFDC และ PsBADH ใน P. stutzeri ST-201 น่าจะทำหน้าที่ในวิถีการย่อยสลายดี-ฟินิลกลัยซีน แทนที่จะเป็นวิถี การย่อยสลายแมนดีเลต
บทคัดย่อ (EN): In this study, the role in D-phenylglycine degradation, gene cloning, expression, purification and characterization of a benzoylformate decarboxylase from Pseudomonas stutzeri ST-201 (PsBFDC) were investigated. Following induction with D-phenylglycine, both D-phenylglycine aminotransferase and then BFDC activity were detected in cultures of P. stutzeri ST-201. Induction with benzoylformate, on the other hand, induced only BFDC activity. Sequential expression of the enzymes demonstrated the role of BFDC in the pathway in a step following D-phenylglycine degradation. Purification and N-terminal sequencing of PsBFDC enabled the design of probes for hybridization in gene cloning. Sequencing of one genomic DNA restriction fragment revealed an open reading frame designated as dpgB which encoded PsBFDC. Sequence alignment also suggested that the gene encoded a thiamin-diphosphate dependent enzyme. A dpgB gene which consisted of 1,581 bps of nucleotides and encoded a polypeptide of 526 amino acids was expressed with pET17b in Escherichia coli BL21 (DE3) and purified to homogeneity in a series of steps including ammonium sulfate fractionation, followed by Phenyl Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography, ultrafiltration and Q-Sepharose FF anion-exchange chromatography with specific activity of 243 U mg-1. Molecular weight (Mr) of the native PsBFDC was estimated to be 224 kDa whereas Mr of the enzyme subunit was approximately 56 kDa. This indicated that the enzyme associated as a homotetramer. The isoelectric point (pI) of the enzyme was 5.2. The temperature and pH for maximal activity were 35-50 oC and 6.0, respectively. Km value for benzoylformate was 0.69 mM and kcat value was 222 s-1. In addition to PsBFDC, in this study a gene encoding a NAD+/NADP+-dependent benzaldehyde dehydrogenase (PsBADH) denoted dpgC was cloned and expressed. Both PsBFDC and PsBADH had high sequence identities (both greater than 85%) and kinetic properties similar to those of the homologous enzymes in the mandelate pathway of P. putida ATCC 12633. However, P. stutzeri ST-201 was unable to grow on either isomer of mandelate, and sequencing indicated that the dpgB gene did not form part of an operon. Thus it appears that the two enzymes form part of a D-phenylglycine, rather than mandelate, degradation pathway.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://dcms.thailis.or.th/dcms/dccheck.php?Int_code=126&RecId=3679&obj_id=4151
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยมหิดล
คำสำคัญ (EN): Enzymes
เจ้าของลิขสิทธิ์: มหาวิทยาลัยมหิดล
รายละเอียด: การศึกษานี้รายงานบทบาทของเอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส (PsBFDC) ใน Pseudomonas stutzeri ST-201 ในการย่อยสลายดี-ฟินิลกลัยซีน รวมถึงการโคลนยีน การทำให้ยีนแสดงออก การ ทำเอนไซม์ให้บริสุทธิ์ และการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ โดยพบว่า P. stutzeri ST-201 สร้างเอนไซม์ดี-ฟินิล กลัยซีน อะมิโนทรานสเฟอเรส และตามด้วย PsBFDC ในเวลาต่อมาเมื่อถูกชักนำด้วยดี-ฟินิลกลัยซีน แต่เแบคทีเรีย ชนิดนี้สร้างเพียง PsBFDC เท่านั้นเมื่อถูกชักนำด้วยเบนโซอิลฟอร์เมต ผลที่ได้แสดงให้เห็นว่า PsBFDC มีบทบาท ในขั้นตอนต่อจากการย่อยสลายดี-ฟินิลกลัยซีน เมื่อแยก PsBFDC จาก P. stutzeri ST-201 และทำให้บริสุทธิ์แล้ว นำไปหาลำดับของกรดอะมิโนด้านปลาย N เพื่อใช้ออกแบบ probe สำหรับทำ hybridization ในการโคลนยีน ได้ ชิ้นดีเอนเอที่มี open reading frame ให้ชื่อว่า dpgB เป็นรหัสสำหรับเอนไซม์ PsBFDC ซึ่งเมื่อทำ sequence alignment พบว่ามีความคล้ายคลึงกับยีนในกลุ่ม thiamin-diphosphate dependent enzymes ยีน dpgB นี้ ประกอบด้วยนิวคลีโอไทด์ 1,581 คู่เบส และสร้างโพลีเปปไทด์ที่ประกอบด้วยกรดอะมิโน 526 ตัว เมื่อนำยีนนี้ซึ่ง โคลนอยู่ในเวกเตอร์ pET17b ไปทำให้เกิดแสดงออกใน Escherichia coli BL21 (DE3) แล้วนำเอนไซม์ที่ได้ไป ผ่านกระบวนการทำให้บริสุทธิ์ซึ่งประกอบด้วยการตกตะกอนโปรตีนด้วย ammonium sulfate ต่อด้วย Phenyl Sepharose FF hydrophobic interaction chromatography, ultrafiltration และ Q-Sepharose FF anion-exchange chromatography ในที่สุดได้เอนไซม์บริสุทธิ์ที่มี specific activity เท่ากับ 243 U mg-1 น้ำหนักโมเลกุลของ native PsBFDC มีค่าประมาณ 224 kDa และหน่วยย่อยของเอนไซม์มีน้ำหนัก 56 kDa นั่นคือเอนไซม์ชนิดนี้ประกอบด้วย หน่วยย่อยที่เหมือนกัน 4 หน่วย เอนไซม์มี isoelectric point (pI) ที่ 5.2 ทำงานได้ดีที่สุดในช่วง 35-50 oC pH 6.0 ค่า Km สำหรับเบนโซอิลฟอร์เมตคือ 0.69 mM และค่า kcat คือ 222 s-1 การศึกษาครั้งนี้ยังสามารถโคลนยีนสำหรับ NAD+/NADP+-dependent benzaldehyde dehydrogenase จาก P. stutzeri ST-201(PsBADH) ซึ่งให้ชื่อว่ายีน dpgC และทำให้เกิดการแสดงออกของยีนได้ เมื่อเปรียบเทียบกับเอนไซม์ในวิถีการย่อยสลายแมนดีเลต พบว่าทั้งเอนไซม์ PsBFDC และ PsBADH มีความคล้ายคลึงทั้งในแง่ลำดับกรดอะมิโน (มากกว่า 85% identity) และคุณสมบัติทาง จลนศาสตร์กับ homologous enzymes ที่พบใน P. putida ATCC 12633 อย่างไรก็ตามเนื่องจาก P. stutzeri ST-201 ไม่สามารถเจริญเติบโตได้โดยใช้แมนดีเลต อีกทั้งยีน dpgB ก็มิได้เป็นส่วนหนึ่งของโอเปอรอน ดังนั้นเอนไซม์ PsBFDC และ PsBADH ใน P. stutzeri ST-201 น่าจะทำหน้าที่ในวิถีการย่อยสลายดี-ฟินิลกลัยซีน แทนที่จะเป็นวิถี การย่อยสลายแมนดีเลต
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Choedchai Saehuan. "เอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส จาก Pseudomonas stutzeri ST-201: การโคลนยีน การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์แลBenzoylformate decarboxylase from Psyeudomonas stutzeri ST-201: gene cloning, enzyme characterization and role in d-phenylglygine degradation". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2550

Choedchai Saehuan. "เอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส จาก Pseudomonas stutzeri ST-201: การโคลนยีน การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์แลBenzoylformate decarboxylase from Psyeudomonas stutzeri ST-201: gene cloning, enzyme characterization and role in d-phenylglygine degradation". มหาวิทยาลัยมหิดล. 2550. Print.



TARR Wordcloud:
เอนไซม์เบนโซอิลฟอร์เมต ดีคาร์บอกซิเลส จาก Pseudomonas stutzeri ST-201: การโคลนยีน การศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์แล
Choedchai Saehuan
มหาวิทยาลัยมหิดล
2550
การผลิตและศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ไฟเทสจากเชื้อ Pseudomonas sp. การทำให้เอนไซม์ไคติเนสบริสุทธิ์และการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์จากเชื้อ escherichia coli ที่ การผลิตเอนไซม์ไฟเทสจาก Pseudomonas putida ที่มียีน appA จาก Escherichia coli การโคลนและการแสดงออกของยีน Nadph-Cytochrome P450 Reductase ในยุงก้นปล่อง Anopheles Minimus และศึกษาการทำงานของเอนไซม์ CYP6P7 ในหลอด การทำบริสุทธิ์และศึกษาคุณลักษณะของเอนไซม์เบต้า-กลูโคซิเดสและสับสเตรทธรรมชาติ จากต้นมะเขือพวง ไคติเนสทนเกลือ : การขยายยีนและการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ ยีนแอลฟากลูโคซิเดสของผึ้งโพรง Apis cerana ในประเทศไทย: ลำดับเบสบางส่วนและเอนไซม์แอกทิวิตี การศึกษาคุณสมบัติของยีนมะเร็งของไวรัส HPV16 : ความหลากหลายของยีน แหล่งที่อยู่และหน้าที่การกระตุ้นการแสดงออกของยีน การวิเคราะห์หาชนิดของเอนไซม์เบต้า การตกผลึกของเอนไซม์ 2-เมทธิล-3-ไฮดรอกซีไพริดีน-5-คาร์บอกซีลิก แอซิด ออกซีจีเนสจากเชื้อแบคทีเรียในดิน Pseudomonas SP. MA-1
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair