สืบค้นงานวิจัย
การโคลนนิ่ง การแสดงออก การทำให้บริสุทธิ์ และคุณลักษณะทางเอนไซม์ของโปรตีนโปรตีเอส NS2B/NS3 ของไวรัสไข้สมองอักเสบ
Chakard Chalayut - มหาวิทยาลัยมหิดล
ชื่อเรื่อง: การโคลนนิ่ง การแสดงออก การทำให้บริสุทธิ์ และคุณลักษณะทางเอนไซม์ของโปรตีนโปรตีเอส NS2B/NS3 ของไวรัสไข้สมองอักเสบ
ชื่อเรื่อง (EN): Cloning expression purification and enzymological characterization of NS2BNS3 protease protein of japanese encephalitis virus
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Chakard Chalayut
บทคัดย่อ: ไวรัสไข้สมองอักเสบ เป็นไวรัสหนึ่งในตระกูลไวรัส Flaviviridae ซึ่งเป็นไวรัสที่มียุงเป็นพาหะนำ ทำให้ก่อโรคที่รุนแรงในระบบประสาทส่วนกลาง ในปัจจุบันมีวัคซีนที่ใช้ในการรักษาแต่ก็มีข้อจำกัดในเนื่องจาก มีราคาสูงและมีโอกาสที่จะเกิดผลข้างเคียงได้ การพัฒนายาที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก ที่สามารถต่อต้านไวรัสโดยมี เป้าหมายคือโปรตีนโปรตีเอส NS2B-NS3 เป็นสิ่งที่จำเป็นอย่างเร่งด่วน ในการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์ที่จะวิเคราะห์ ความแตกต่างของการกระตุ้นด้วยโคเฟคเตอร์ของโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ระหว่างไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้ สมองอักเสบ ด้วยการจำแนกส่วนประกอบทั้ง 2 ของโปรตีนด้วยวิธีการที่รวดเร็ว ตอบสนองไวและง่ายที่จะทำการ วิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้นที่เรืองแสงฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งในการศึกษานี้ได้พัฒนาวิธีการโคลนนิ่ง การแสดงออกของ โปรตีนและทำโปรตีนของโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอักเสบให้บริสุทธิ์และใช้สารตั้งต้นที่เป็นเปปไทด์ที่มีสารเรือง แสงฟลูออเรสเซนต์ (amc) ในการทดลอง ลำดับพันธุกรรม NS2B-NS3 จากไวรัสไข้สมองอักเสบได้ถูกสังเคราะห์ และเป็นต้นแบบในการสร้างลำดับพันธุกรรมของโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ด้วยวิธีการ SOE-PCR ลำดับ พันธุกรรมดังกล่าวได้ทำการโคลนนิ่งและทำการแสดงออกในแบคทีเรีย E.coli และทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี metal affinity chromatography และ size exclusion chromatography จากนั้นโปรตีนได้ทำการตรวจสอบวิเคราะห์โดย SDS-PAGE, western blotting และทำการทดสอบวิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้น RTKR-amc และ GRR-amc การศึกษา ทางจลศาสตร์แสดงให้เห็นถึงค่าจลศาสตร์ของโปรตีนโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอเสบและความแตกต่างระหว่าง โปรตีนของไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้สมองอักเสบ อย่างไรก็ตามโปรตีนของไวรัสไข้สมองอักเสบมีการตอบสนอง ต่อค่า pH และ ionic strength ที่เหมือนกัน ซึ่งการค้นพบครั้งนี้ทำให้เข้าใจคุณลักษณะโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ของ ไวรัสไข้สมองอักเสบต่อไวรัสสายพันธุ์ Flavivirus ได้ดีขึ้น และเป็นจุดเริ่มต้นในการจำแนกสารตั้งต้นที่มี ความจำเพาะและใช้ในการออกแบบสารยับยั้งต่อโปรตีเอสของไวรัสไข้สมองอักเสบได้ต่อไป
บทคัดย่อ (EN): Japanese Encephalitis Virus (JEV), a member of the Flaviviridae family, is a mosquito borne neurotropic flavivirus that causes severe diseases of the central nervous system. Currently, several vaccines are in clinical use, however, their use is restricted due to high costs and occasional adverse effects. The development of small molecule drugs against viral target enzymes such as the NS2B-NS3 protease therefore are urgently required. This study therefore aimed to analyze the differences in the mechanism of cofactor activation between dengue virus and Japanese encephalitis virus NS2B(H)-NS3(pro) by characterization of the two-component protease by establishing a rapid, sensitive and easy to perform assay with the fluorogenic substrates. In this study, the peptide substrates incorporated with fluorogenic group (amc) were used and a general methodology for the cloning, expression and purification of the Japanese encephalitis virus protease was developed. The sequence of NS2B-NS3 from JEV was obtained by synthetic gene. The protease complex NS2B(H)- NS3pro was obtained by SOE-PCR. Constructs were cloned and over expressed in E.coli, purified by metal affinity chromatography and size exclusion, then the protein sample was subjected to analysis by SDS-PAGE, Western Blotting and a fluorogenic assay with the synthetic substrate RTKR-amc and GRR-amc. Kinetic studies revealed the kinetic parameters (Km, kcat) and also demonstrated kinetic differences between dengue and Japanese encephalitis virus. However, the Japanese Encephalitis virus protease is similar in pH and ionic strength to the Dengue virus. These novel findings make for a better understanding of the NS2B(H)- NS3(pro) of Japanese encephalitis virus to the related Flavivirus and provide a starting point for further characterization of substrate specificity and inhibitor design for the JEV protease.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://dcms.thailis.or.th/dcms/dccheck.php?Int_code=126&RecId=5925&obj_id=5713
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยมหิดล
คำสำคัญ (EN): Flavivirus
เจ้าของลิขสิทธิ์: มหาวิทยาลัยมหิดล
รายละเอียด: ไวรัสไข้สมองอักเสบ เป็นไวรัสหนึ่งในตระกูลไวรัส Flaviviridae ซึ่งเป็นไวรัสที่มียุงเป็นพาหะนำ ทำให้ก่อโรคที่รุนแรงในระบบประสาทส่วนกลาง ในปัจจุบันมีวัคซีนที่ใช้ในการรักษาแต่ก็มีข้อจำกัดในเนื่องจาก มีราคาสูงและมีโอกาสที่จะเกิดผลข้างเคียงได้ การพัฒนายาที่มีโมเลกุลขนาดเล็ก ที่สามารถต่อต้านไวรัสโดยมี เป้าหมายคือโปรตีนโปรตีเอส NS2B-NS3 เป็นสิ่งที่จำเป็นอย่างเร่งด่วน ในการศึกษานี้มีวัตถุประสงค์ที่จะวิเคราะห์ ความแตกต่างของการกระตุ้นด้วยโคเฟคเตอร์ของโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ระหว่างไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้ สมองอักเสบ ด้วยการจำแนกส่วนประกอบทั้ง 2 ของโปรตีนด้วยวิธีการที่รวดเร็ว ตอบสนองไวและง่ายที่จะทำการ วิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้นที่เรืองแสงฟลูออเรสเซนต์ ซึ่งในการศึกษานี้ได้พัฒนาวิธีการโคลนนิ่ง การแสดงออกของ โปรตีนและทำโปรตีนของโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอักเสบให้บริสุทธิ์และใช้สารตั้งต้นที่เป็นเปปไทด์ที่มีสารเรือง แสงฟลูออเรสเซนต์ (amc) ในการทดลอง ลำดับพันธุกรรม NS2B-NS3 จากไวรัสไข้สมองอักเสบได้ถูกสังเคราะห์ และเป็นต้นแบบในการสร้างลำดับพันธุกรรมของโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ด้วยวิธีการ SOE-PCR ลำดับ พันธุกรรมดังกล่าวได้ทำการโคลนนิ่งและทำการแสดงออกในแบคทีเรีย E.coli และทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี metal affinity chromatography และ size exclusion chromatography จากนั้นโปรตีนได้ทำการตรวจสอบวิเคราะห์โดย SDS-PAGE, western blotting และทำการทดสอบวิเคราะห์ด้วยสารตั้งต้น RTKR-amc และ GRR-amc การศึกษา ทางจลศาสตร์แสดงให้เห็นถึงค่าจลศาสตร์ของโปรตีนโปรตีเอสไวรัสไข้สมองอเสบและความแตกต่างระหว่าง โปรตีนของไวรัสเดงกี่และไวรัสไข้สมองอักเสบ อย่างไรก็ตามโปรตีนของไวรัสไข้สมองอักเสบมีการตอบสนอง ต่อค่า pH และ ionic strength ที่เหมือนกัน ซึ่งการค้นพบครั้งนี้ทำให้เข้าใจคุณลักษณะโปรตีน NS2B(H)-NS3(pro) ของ ไวรัสไข้สมองอักเสบต่อไวรัสสายพันธุ์ Flavivirus ได้ดีขึ้น และเป็นจุดเริ่มต้นในการจำแนกสารตั้งต้นที่มี ความจำเพาะและใช้ในการออกแบบสารยับยั้งต่อโปรตีเอสของไวรัสไข้สมองอักเสบได้ต่อไป
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง


TARR Wordcloud:
การโคลนนิ่ง การแสดงออก การทำให้บริสุทธิ์ และคุณลักษณะทางเอนไซม์ของโปรตีนโปรตีเอส NS2B/NS3 ของไวรัสไข้สมองอักเสบ
Chakard Chalayut
มหาวิทยาลัยมหิดล
2552
การทำให้อัลคาไลน์โปรตีเอสที่ผลิตจาก alkalotolerant Bacillus sp. B12 บริสุทธิ์และศึกษาสมบัติต่าง ๆ การคัดกรองและการหาสภาวะที่เหมาะสมสาหรับการผลิตเอนไซม์โปรตีเอสโดยแบคทีเรียย่อยสลายโปรตีนเพื่อใช้ในการกาจัดโปรตีนในเปลือ การทำให้เอนไซม์ไคติเนสบริสุทธิ์และการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์จากเชื้อ escherichia coli ที่ การผลิตและการทำให้ starch-binding amylase จาก alkaliphilic Bacillus sp. SS-8 บริสุทธิ์และศึกษาสมบัติต่าง ๆ ของเอนไซม์บริสุทธิ์ การแสดงออกและการศึกษาคุณลักษณะหน้าที่ทางชีวเคมีของโปรตีน Argonaute ในกุ้งกุลาดำ การศึกษาความสามารถในการกระตุ้นภูมิคุ้มกันของ Recombinant โปรตีนจากเชื้อไวรัสไข้หวัดนก การทำให้บริสุทธิ์ของโปรตีนจาก Bacillus subtilis N3 ที่มีฤทธิ์ต้านราก่อโรคพืช Bipolaris sp. การโคลนยีนการแสดงออกและคุณสมบัติทางชีววิทยาของโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งไรโบโซมประเภทที่ การวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนในเม็ดเลือดปูทะเลที่ติดโรคไวรัสตัวแดงดวงขาว การศึกษาในโคลนและการแสดงออกของยีนที่ควบคุมเอนไซ
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก