สืบค้นงานวิจัย
การออกแบบดีเอ็นเอไพรเมอร์เพื่อโคลนยีนไคทิเนสจาก Bacillus licheniformis PR-1
Prakarn Ruldeekulthamrong - จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
ชื่อเรื่อง: การออกแบบดีเอ็นเอไพรเมอร์เพื่อโคลนยีนไคทิเนสจาก Bacillus licheniformis PR-1
ชื่อเรื่อง (EN): Design of DNA primers for chitinase gene cloning from Bacillus licheniformis PR-1
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Prakarn Ruldeekulthamrong
บทคัดย่อ: ไคทิเนส (EC 3.2.1.14) เป็นเอนไซม์ที่เร่งปฏิกริยาการย่อยสลายไคทิน Bacillus licheniformis PR-1 ที่แยกได้จากดินในประเทศไทย ผลิตเอนไซม์ไคทิเนสได้ และผลิตเอนไซม์สูงสุดในวันที่ 8 และ 5 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีคอลลอยด์ดัลไคทินที่มี yeast extract 0.05 % และ 0.25 % ตามลำดับ ค่าความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมที่ทำให้ไคทิเนสมีแอคติวิตีสูงสุด คือ 5.0 และ 70 ?C ตามลำดับ เอนไซม์ไคติเนสย่อยสลายคอลลอยด์ดัลไคทินได้ดีที่สุด รองลงมาคือ powder chitin, 80 % DD chitosan, flake chitin และ regenerated chitin ตามลำดับ ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยสลายคอลลอยด์ดัลไคทินได้เป็น chitobiose และ N-acetylglucosamine โดยมี chitobiose เป็นผลิตภัณฑ์หลัก เมื่อทำการแยกโปรตีนโดย SDS-PAGE และย้อม แอคติวิตี พบโปรตีนที่มีไคทิเนสแอคติวิตี 3 แถบที่มีขนาดต่างๆ คือ 70, 65 และ 58 กิโลดาลตัล ตามลำดับ ดีเอ็นเอไพรเมอร์ BP-I, II, V, VI, VII, VIII, IX, BP-F และ BP-R ที่ออกแบบมีความจำเพาะต่อยีนไคติเนส family 18 ของ Bacillus spp. และสามารถใช้เพิ่มจำนวนยีนไคทิเนสได้ครบทั้งยีน เมื่อนำโครโมโซมัลดีเอ็นเอมาตัดแบบไม่สมบูรณ์แล้ว ทำ shotgun cloning พบสองโคโลนีจาก 8,000 โคโลนี ที่สามารถเกิดวงใสบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งที่มีคอลลอยด์ดัลไคทิน โดยทรานสฟอร์แมนท์มีพลาสมิดที่มีชิ้นดีเอ็นเอขนาด 5 และ 3 kb แทรกอยู่ มีเพียงทรานสฟอร์แมนท์ที่มีพลาสมิดที่ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 5 kb แทรกอยู่ตั้งชื่อว่า pPRChi65 เท่านั้นที่มีการผลิตเอนไซม์ออกมาหลังจากรีทรานส์ฟอร์มเข้า E.coli JM109, DH5a และ XL-1 blue และผลิตเอนไซม์ได้ดีที่สุดใน JM109 โปรโมเตอร์ของ pPRChi65 สามารถถูกยับยั้งได้เมื่อเลี้ยง E.coli JM109 ในอาหาร LB ที่มีกลูโคสอยู่ เมื่อทำการศึกษาสมบัติบางประการของเอนไซม์ CHI65 พบว่าสภาวะที่เหมาะสมที่มีแอคติวิตีมากที่สุดอยู่ที่ค่าความเป็นกรด-ด่าง 5.0 และอุณหภูมิ 60?C ตามลำดับ เมื่อหา open reading frame พบว่ามีสองยีน คือ Chi65 ที่มีขนาด 1,779 คู่เบส เมื่อนำมาแปลรหัสเป็นกรดอะมิโนจะได้ กรดอะมิโน 592 ตัว ซึ่งมีขนาดประมาณ 65,100 Da มี isoelectric point เท่ากับ 5.84 และในอีกยีนหนึ่งเป็น chitodextrinase ซึ่งได้ไม่ครบทั้งยีน กรดอะมิโนของ Chi65 ที่ได้มีความคล้ายคลึง 89 % และ 79% กับยีนไคติเนสจาก B. liceniformis M1-1 และ B. subtilis ตามลำดับ ส่วนการศึกษาการย่อยไคทินของ Chi65 พบว่าเอนไซม์ไคติเนสย่อยสลายคอลลอยด์ดัลไคทินได้ดีที่สุด รองลงมาคือ powder chitin, flake chitin, 80 % DD chitosan และ regenerated chitin ตามลำดับ ผลจาก SDS-PAGE และย้อมสีแอคติวิตีพบแถบโปรตีนที่มีไคทิเนสแอคติวิตี 3 แถบ มีขนาด 70, 65 และ 58 kDa เหมือนกับ B. licheniformis PR-1 และยังพบอีกว่าผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยสลายได้คอลลอยด์ดัลไคทินเป็น chitobiose และ N-acetylglucosamine เช่นเดียวกัน
บทคัดย่อ (EN): chitobiose was the major products. SDS-PAGE and activity staining of crude enzymes showed three bands with chitinase activity. The estimated molecular weights of the major chitinase species were 70, 65 and 58 kDa. Designed primers (BP-I, II, V, VI, VII, VIII, IX, BP-F and BP-R) that were specific for familly 18 chitinases among Bacillus sp., were able to amplified full length chitinase genes. Shotgun cloning of the PstI partially cut genomic DNA of B. licheniformis PR-1 was performed. Two transformants from 8,000 colonies showed clear zones with inserted fragment of 5 and 3 kb, respectively. Only one plasmid, pPRChi65, had chitinase activity and produced highest chitinase activity in E.coli JM109. The promotor of Chi65 could be suppressed when grown in LB medium with glucose. Crude chitinase from pPRChi65 was characterized. The optimum pH and temperature were pH 5.0 in citrate buffer and 60 oC, respectively. Two open reading frame were found in the 5 kb inserted. One is 1,779 bp long encoding for a protein 593 amino acids, which correspond to 65,100 Da with isoelectric point of 5.84 and the other is not a complete sequence for chitodextrinase. The amino acid comparison indicated Chi65 is 89 % similar to chitinase from B. licheniformis TP-1 followed by 79 % chitinase from B. subtilis. Crude chitinase hydrolyzed colloidal chitin the best followed by 80 % DD, powder chitin, flake chitin and regenerated chitin. SDS-PAGE and activity staining of crude enzyme of recombinant clone showed three bands with were chitinase activity. The molecular weights were approximately 70, 65 and 58 kDa, which is the same as crude chitinase from B. licheniformis PR-1. Determination of hydrolytic products by HPLC, found a mixture of chitobiose and GlcNAc from pPRChi65.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://cuir.car.chula.ac.th/handle/123456789/10858
เผยแพร่โดย: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
คำสำคัญ (EN): Molecular cloning
เจ้าของลิขสิทธิ์: Chulalongkorn University
รายละเอียด: ไคทิเนส (EC 3.2.1.14) เป็นเอนไซม์ที่เร่งปฏิกริยาการย่อยสลายไคทิน Bacillus licheniformis PR-1 ที่แยกได้จากดินในประเทศไทย ผลิตเอนไซม์ไคทิเนสได้ และผลิตเอนไซม์สูงสุดในวันที่ 8 และ 5 เมื่อเลี้ยงในอาหารที่มีคอลลอยด์ดัลไคทินที่มี yeast extract 0.05 % และ 0.25 % ตามลำดับ ค่าความเป็นกรด-ด่างและอุณหภูมิที่เหมาะสมที่ทำให้ไคทิเนสมีแอคติวิตีสูงสุด คือ 5.0 และ 70 ?C ตามลำดับ เอนไซม์ไคติเนสย่อยสลายคอลลอยด์ดัลไคทินได้ดีที่สุด รองลงมาคือ powder chitin, 80 % DD chitosan, flake chitin และ regenerated chitin ตามลำดับ ผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยสลายคอลลอยด์ดัลไคทินได้เป็น chitobiose และ N-acetylglucosamine โดยมี chitobiose เป็นผลิตภัณฑ์หลัก เมื่อทำการแยกโปรตีนโดย SDS-PAGE และย้อม แอคติวิตี พบโปรตีนที่มีไคทิเนสแอคติวิตี 3 แถบที่มีขนาดต่างๆ คือ 70, 65 และ 58 กิโลดาลตัล ตามลำดับ ดีเอ็นเอไพรเมอร์ BP-I, II, V, VI, VII, VIII, IX, BP-F และ BP-R ที่ออกแบบมีความจำเพาะต่อยีนไคติเนส family 18 ของ Bacillus spp. และสามารถใช้เพิ่มจำนวนยีนไคทิเนสได้ครบทั้งยีน เมื่อนำโครโมโซมัลดีเอ็นเอมาตัดแบบไม่สมบูรณ์แล้ว ทำ shotgun cloning พบสองโคโลนีจาก 8,000 โคโลนี ที่สามารถเกิดวงใสบนอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งที่มีคอลลอยด์ดัลไคทิน โดยทรานสฟอร์แมนท์มีพลาสมิดที่มีชิ้นดีเอ็นเอขนาด 5 และ 3 kb แทรกอยู่ มีเพียงทรานสฟอร์แมนท์ที่มีพลาสมิดที่ชิ้นดีเอ็นเอขนาด 5 kb แทรกอยู่ตั้งชื่อว่า pPRChi65 เท่านั้นที่มีการผลิตเอนไซม์ออกมาหลังจากรีทรานส์ฟอร์มเข้า E.coli JM109, DH5a และ XL-1 blue และผลิตเอนไซม์ได้ดีที่สุดใน JM109 โปรโมเตอร์ของ pPRChi65 สามารถถูกยับยั้งได้เมื่อเลี้ยง E.coli JM109 ในอาหาร LB ที่มีกลูโคสอยู่ เมื่อทำการศึกษาสมบัติบางประการของเอนไซม์ CHI65 พบว่าสภาวะที่เหมาะสมที่มีแอคติวิตีมากที่สุดอยู่ที่ค่าความเป็นกรด-ด่าง 5.0 และอุณหภูมิ 60?C ตามลำดับ เมื่อหา open reading frame พบว่ามีสองยีน คือ Chi65 ที่มีขนาด 1,779 คู่เบส เมื่อนำมาแปลรหัสเป็นกรดอะมิโนจะได้ กรดอะมิโน 592 ตัว ซึ่งมีขนาดประมาณ 65,100 Da มี isoelectric point เท่ากับ 5.84 และในอีกยีนหนึ่งเป็น chitodextrinase ซึ่งได้ไม่ครบทั้งยีน กรดอะมิโนของ Chi65 ที่ได้มีความคล้ายคลึง 89 % และ 79% กับยีนไคติเนสจาก B. liceniformis M1-1 และ B. subtilis ตามลำดับ ส่วนการศึกษาการย่อยไคทินของ Chi65 พบว่าเอนไซม์ไคติเนสย่อยสลายคอลลอยด์ดัลไคทินได้ดีที่สุด รองลงมาคือ powder chitin, flake chitin, 80 % DD chitosan และ regenerated chitin ตามลำดับ ผลจาก SDS-PAGE และย้อมสีแอคติวิตีพบแถบโปรตีนที่มีไคทิเนสแอคติวิตี 3 แถบ มีขนาด 70, 65 และ 58 kDa เหมือนกับ B. licheniformis PR-1 และยังพบอีกว่าผลิตภัณฑ์ที่ได้จากการย่อยสลายได้คอลลอยด์ดัลไคทินเป็น chitobiose และ N-acetylglucosamine เช่นเดียวกัน
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Prakarn Ruldeekulthamrong. "การออกแบบดีเอ็นเอไพรเมอร์เพื่อโคลนยีนไคทิเนสจาก Bacillus licheniformis PR-1Design of DNA primers for chitinase gene cloning from Bacillus licheniformis PR-1". จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. 2544

Prakarn Ruldeekulthamrong. "การออกแบบดีเอ็นเอไพรเมอร์เพื่อโคลนยีนไคทิเนสจาก Bacillus licheniformis PR-1Design of DNA primers for chitinase gene cloning from Bacillus licheniformis PR-1". จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. 2544. Print.



TARR Wordcloud:
การออกแบบดีเอ็นเอไพรเมอร์เพื่อโคลนยีนไคทิเนสจาก Bacillus licheniformis PR-1
Prakarn Ruldeekulthamrong
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
2544
การพิสูจน์ยืนยันดีเอ็นเอของไก่ โดยใช้ไพรเมอร์ ที่จำเพาะต่อยีนไซโตโครม บี การจัดเรียงตัวของยีนและการเกิดดีเอ็นเอเมทิลเลชั่นบนโปรโมเตอร์ในพืชที่ผ่านกระบวนการถ่ายยีน การโคลนและการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนไคทิเนสจาก Burkholderia cepacia TU09 การตรวจหายีน CTX ของ Vibrio cholerae ด้วยวิธีควอทซ์คริสตัลไมโครบาลานซ์ ดีเอ็นเอเซ็นเซอร์ ผลของแคดเมียมต่อโปรตีนจีเอพีดีเอชและการแสดงออกของยีนนีโมในส่วนที่มีความสัมพันธ์กับยีนของเอ็นไซม์จี-6-พีดีในเซลล์เฮปจี2 การโคลนและการแสดงออกของยีนไคติเนสที่แยกได้จาก Beauveria bassiana ใน Escherichia Coli การศึกษาในโคลนและการแสดงออกของยีนที่ควบคุมเอนไซ การโคลนยีนจากพยาธิใบไม้ในตับชนิด Opisthorchis Viverrini และการวิเคราะห์โปรตีนที่ได้จากยีนต้นแบบ พฤติกรรมของเซลล์ไฟโบรบลาสต์จากเอมบริโอหนูตัดต่อยีนซึ่งผลิตสารเวอร์ชิแคนที่ขาดส่วน เอ ซับโดเม การตรวจสอบดีเอ็นเอเมทิลเลชันในการออกดอกของผักกาดขาวปลี (Brassica campestris subsp. pekinensis)ที่ชักนำโดยปัจจัยต่างๆ ด้วยเทคนิคเอชเอที-อาร์เอพีดี
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair