สืบค้นงานวิจัย
การศึกษาการแสดงออกของยีนไคติเนสจาก Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus [HaNPV] สายพันธุ์ไทยใน baculovirus expression insect cell system
จักราการ เจนการ - มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี
ชื่อเรื่อง: การศึกษาการแสดงออกของยีนไคติเนสจาก Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus [HaNPV] สายพันธุ์ไทยใน baculovirus expression insect cell system
ชื่อเรื่อง (EN): Expression of Chitbase Gene from a Thai-isolated Helicoverpa armigera Nucleopolyhedrovirus (HaNFV) in Baculovirus
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ: จักราการ เจนการ
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Juggragam Jengam
บทคัดย่อ: ในการศึกษาการแสดงออกของยีนไคติเนสจากแบคคิวโลไวรัส Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus สายพันธุ์ไทย (Th-HaSNPV) ในระบบ baculovirus expression insect cell system นี้ใช้วิธีการโคลนยีนไคติเนสเข้าสู่แบคคิวโลไวรัส Autographa californica multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus [AcMNPV bacmid] ซึ่งเป็น shuttle vector ระหว่างแบคคิวโลไวรัสและแบคทีเรียเพื่อให้มีการแสดงออกในเซลล์แมลง โดย recombinant AcMNPV bacmid ได้รับยีน HaSNPV chitinase เข้าสู่จีโนมด้วยวิธี transposition ภายในเซลล์ E.coli [DH10Bac.] ซึ่งได้รับการยืนยันผลการแทรกของ HaSNPV chitinase gene ด้วยวิธี PCR จากนั้นจึงนำไปtransfection เข้าสู่เซลล์แมลง (SF-9) เพื่อให้ได้อนุภาคไวรัสที่สมบูรณ์สำหรับใช้ infect เซลล์แมลงเพื่อสังเคราะห์ recombinant HaSNPV chitinase จากการตรวจสอบโปรตีนที่คาดว่าเป็น recombinant HaSNPV chitinase ในเซลล์แมลงด้วยวิธี SDS-PAGE และ active-PAGE ยังไม่สามารถชี้ชัดได้ว่ามีการแสดงออกของ recombinant HaSNPV chitinase เนื่องจากใน AcMNPV bacmid มีการแสดงออกของ AcMNPV chitinase เองอยู่แล้วและมีขนาดมวลโมเลกุลที่ใกล้เคียงกันมาก ดังนั้นจึงต้องทำการยังยั้งการแสดงของ AcMNPV chitinase gene ใน AcMNPV bacmid ก่อนในการศึกษานี้ใช้วิธียับยั้งการแสดงออกของยีน AcMNPV chitinase โดยการนำยีน GFP เข้าแทรกตรง กลางเพื่อขัดขวางการแสดงออกของยีนนี้ด้วยวิธี homologous recombination ซึ่งต้องอาศัยhomologous sequence ในการทำให้เกิดการแลกเปลี่ยนระหว่างยีนในจีโนมและยีนใหม่โดยทำการศึกษาใน 2 กรณี คือ 1)กรณีที่ homologous sequence มีความเหมือนกับจีโนม 66% โดยใช้ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ HaSNPV chitinase gene(ที่อยู่บนพลาสมิด pNVBGFP) พบว่า recombinantbacmid ที่ได้หลังจาก cotransfection มีการเรืองแสงสีเขียว ซึ่งมีวิธีทำไวรัสให้บริสุทธิ์ได้ 2 วิธี คือ วิธีplaque purification อย่างน้อย 4 รอบ (ใช้เวลา 4-6 สัปดาห์) จึงได้ไวรัสที่ปราศจากการเจือป่นของไวรัสเดิม และอีกวิธีหนึ่ง คือ คัดเลือก recombinant bacmid โดยการใช้ colony selection เนื่องจากbacmid เป็น baculovirus-bacteria shuttle vector พบว่าวิธีนี้ช่วยย่นระยะเวลาในการทำให้ไวรัส บริสุทธิ์ โดยคัดเลือกโคโลนีของแบคทีเรียที่มี recombinant AcMNPV bacmid ที่ต้องการ นำไปสกัด DNA เพื่อตรวจสอบการแทรกของ GFP gene ด้วยวิธี PCR ได้ภายใน 1-2 สัปดาห์ ผลการใช้ความเหมือนของลำดับนิวคลีโอไทด์บริเวณ homologous region เพียง 66% นั้น พบว่ามีการเข้าแทรกของGFP gene ในตำแหน่งที่ไม่จำเพาะกับยีนไคติเนส ทำให้ไม่สามารถขัดขวางการแสดงออกได้ จึงได้ทำการเปลียนเป็น 2)กรณีที่ homologous sequence มีความเหมือน 100% โดยเปลี่ยนเป็น AcMNPV chitinase gene (ที่อยู่บนพลาสมิด pAcchiGFP) เพื่อแทรก GFP gene พบว่าเกิดการเข้าแทรกของ GFP gene เข้าสู่จีโนมของ AcMNPV ที่ตำแหน่งจำเพาะกับยีนไคติเนสเมื่อตรวจสอบด้วยวิธี PCR และภายหลังการคัดเลือก recombinant baculovirus ด้วยวิธี colony selection และทำการเตรียมไวรัสในเซลล์แมลง และเมื่อนำมาตรวจสอบกิจกรรมเอนไซม์ไคติเนส พบว่าไม่มีกิจกรรมของเอนไซม์ ไคติเนส การศึกษานี้แสดงว่าสามารถนำวิธี homologous recombination มาใช้กับAcMNPV bacmid เพื่อใช้ในการทำพันธุ์วิศวกรรมยีนต่างๆของ bacmid ได้(โดยต้องมี homologous sequence ที่มีความเหมือน homology มากเพียงพอ) โดยไม่ต้องจำกัดที่การทำ transposition บริเวณที่มี transposon attachment site ของ bacmid เพียงอย่างเดียว นอกจากนี้การทำ homologous recombination ของ bacmid ยังสามารถใช้วิธี colony selection เพื่อตรวจหาและแยก recombinant bacmid โดยการคัดเลือกโคโลนีได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบกว่าการใช้แบคคิวโลไวรัสทั่วไป ซึ่งยังต้องใช้วิธี plaque purification ในการคัดเลือก recombinant baculovirus ที่ต้องการ
บทคัดย่อ (EN): Expression of chitinase gene of Thai isolated Helicove~n armigera single nucleocapsid nucIeopolyhedrovirus (Th-HaSNPV) in baculovirus expression insect cell system was performed in this study using Atttographa califomica multinucleocapsid nuleopolyhedrovirus (AcMNPV) bacmid, baculovirus-bacteria shuttle vector. HaSNPV chitinase gene was inserted into AcMNPV bacmid by transposition at transposon attachment site in E. coIi (DHIOB~cCe lls). Recombinant AcMNPV bacmid with HaSNPV chitinase gene inserted into its genome via transposition process was purified &om bacteria and confumed by PCR analysis- The recombinant bacmid was used for transfection into insect cells. During transfeetion, recombinant baculovirus particles were formed and released to infect into neighboring insect cells to produce recombinant HaSNPV chitinase enzyme. SDS-PAGE and active-PAGE analysis were performed to detect expression of recombinant HaSNPV chitinase. However, the HaSNPV chitinase expression can not be confumed since the expression of AcMNPV chitinase gene of bacmid itself was also observed at approximately the same molecular weight. In order to use the AcMNPV bacmid as an expression vector fix HaSNPV chitinase gene, AcMNPV chitinase gene expression in AcMNPV bacmid must first be interrupted. In Phis study, insertion of GFP gene in the middle of AcMNPV chitinase gene by homologous recombination was performed for AcMNPV chitinase gene disruption. Two homologous sequences for recombination were tested. The fmt sequence was the use of HaSNPV chitinase which had 66% identity to the AcMNPV bacmid on the pNVBGFP as homologous region. Recombinant AcMNPV bacmid infected into insect ceU (SF-9) produced virus progeny with green fluorescent. Isolation of recombinant AcMNPV bacdovirus expressing GFP was performed by 4 rounds plaque purification which takes long time (4-6 weeks). An alternative method for selection of recombinant bacmid was therefore proposed Since the AcMNPV bacrnid is bacdovirus-bacteria shuttle vector, colony selection method was choosen. A single colony was selected. Confiation of GFP gene insertion into A c Wba cmid extracted from each colony was performed by PCR analysis and recombinant bacmid expressing GFP can be selected in shorter time (1-2 weeks). However, analysis of insertion of GFP gene into AcMNPV chitinase gene by PCR shows no GFP gene at specific chitinase gene. The second sequence with 1Wh homology (AcMNPV chitinasel was therefore used. It was found that after homologous recombination, the recombinant baculovhs expressing GFP had GFP gene inserted at specific AcMNPV chitinase gene and no acitivity of AcMNPV chitinase in infected insect cells which infected by this recombinant AcMNPV baculovirus was observed. This study demonstrated that homologous recombination method (with high % homology of homologous sequence) can be applied with AcMNPV bacmid for genetic engineering of any genes of the bacmid rather than limiting at the transposition attachment site that is generally used of barmid. In addition, colony selection of recombinant bacmid after homologous recumbination can be used for separation of recombinant and parental bacmid in shorter time compare to plaque purification.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://dcms.thailis.or.th/dcms/dccheck.php?Int_code=54&RecId=8891&obj_id=25269
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี
คำสำคัญ: กระบวนการ transposition
คำสำคัญ (EN): AcMNPV bacmid
เจ้าของลิขสิทธิ์: มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี
รายละเอียด: Expression of chitinase gene of Thai isolated Helicove~n armigera single nucleocapsid nucIeopolyhedrovirus (Th-HaSNPV) in baculovirus expression insect cell system was performed in this study using Atttographa califomica multinucleocapsid nuleopolyhedrovirus (AcMNPV) bacmid, baculovirus-bacteria shuttle vector. HaSNPV chitinase gene was inserted into AcMNPV bacmid by transposition at transposon attachment site in E. coIi (DHIOB~cCe lls). Recombinant AcMNPV bacmid with HaSNPV chitinase gene inserted into its genome via transposition process was purified &om bacteria and confumed by PCR analysis- The recombinant bacmid was used for transfection into insect cells. During transfeetion, recombinant baculovirus particles were formed and released to infect into neighboring insect cells to produce recombinant HaSNPV chitinase enzyme. SDS-PAGE and active-PAGE analysis were performed to detect expression of recombinant HaSNPV chitinase. However, the HaSNPV chitinase expression can not be confumed since the expression of AcMNPV chitinase gene of bacmid itself was also observed at approximately the same molecular weight. In order to use the AcMNPV bacmid as an expression vector fix HaSNPV chitinase gene, AcMNPV chitinase gene expression in AcMNPV bacmid must first be interrupted. In Phis study, insertion of GFP gene in the middle of AcMNPV chitinase gene by homologous recombination was performed for AcMNPV chitinase gene disruption. Two homologous sequences for recombination were tested. The fmt sequence was the use of HaSNPV chitinase which had 66% identity to the AcMNPV bacmid on the pNVBGFP as homologous region. Recombinant AcMNPV bacmid infected into insect ceU (SF-9) produced virus progeny with green fluorescent. Isolation of recombinant AcMNPV bacdovirus expressing GFP was performed by 4 rounds plaque purification which takes long time (4-6 weeks). An alternative method for selection of recombinant bacmid was therefore proposed Since the AcMNPV bacrnid is bacdovirus-bacteria shuttle vector, colony selection method was choosen. A single colony was selected. Confiation of GFP gene insertion into A c Wba cmid extracted from each colony was performed by PCR analysis and recombinant bacmid expressing GFP can be selected in shorter time (1-2 weeks). However, analysis of insertion of GFP gene into AcMNPV chitinase gene by PCR shows no GFP gene at specific chitinase gene. The second sequence with 1Wh homology (AcMNPV chitinasel was therefore used. It was found that after homologous recombination, the recombinant baculovhs expressing GFP had GFP gene inserted at specific AcMNPV chitinase gene and no acitivity of AcMNPV chitinase in infected insect cells which infected by this recombinant AcMNPV baculovirus was observed. This study demonstrated that homologous recombination method (with high % homology of homologous sequence) can be applied with AcMNPV bacmid for genetic engineering of any genes of the bacmid rather than limiting at the transposition attachment site that is generally used of barmid. In addition, colony selection of recombinant bacmid after homologous recumbination can be used for separation of recombinant and parental bacmid in shorter time compare to plaque purification.
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

จักราการ เจนการ. "การศึกษาการแสดงออกของยีนไคติเนสจาก Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus [HaNPV] สายพันธุ์ไทยใน baculovirus expression insect cell systemExpression of Chitbase Gene from a Thai-isolated Helicoverpa armigera Nucleopolyhedrovirus (HaNFV) in Baculovirus". มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. 2548

จักราการ เจนการ. "การศึกษาการแสดงออกของยีนไคติเนสจาก Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus [HaNPV] สายพันธุ์ไทยใน baculovirus expression insect cell systemExpression of Chitbase Gene from a Thai-isolated Helicoverpa armigera Nucleopolyhedrovirus (HaNFV) in Baculovirus". มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี. 2548. Print.



TARR Wordcloud:
การศึกษาการแสดงออกของยีนไคติเนสจาก Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus [HaNPV] สายพันธุ์ไทยใน baculovirus expression insect cell system
จักราการ เจนการ
มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีพระจอมเกล้าธนบุรี
2548
การโคลนและการแสดงออกของยีนไคติเนสที่แยกได้จาก Beauveria bassiana ใน Escherichia Coli ความแตกต่างระหว่างพันธุ์ข้าวไทยในการปรับตัวต่อสภาพดินไม่ขังน้ำ การคัดกรองและการแยกยีนไคติเนสจากเชื้อราสาเหตุโรคแมลงเพื่อเพิ่มการเข้าทำลายหนอนใบผัก การเปรียบเทียบสมรรถภาพการผลิตและองค์ประกอบซากของไก่เนื้อสายพันธุ์การค้า 3 สายพันธุ์ที่นิยมเลี้ยงในประเทศไทย การคัดเลือกประชากรข้าวลูกผสมรวมหมู่ระหว่างข้าวพันธุ์เหมยนองพื้นเมืองทนทานแมลงบั่วและพันธุ์ปทุมธานี 1 ในสภาพแวดล้อมแตกต่างกัน ไคติเนสทนเกลือ : การขยายยีนและการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ การวิเคราะห์ผลกระทบของนโยบายกระตุ้นเศรษฐกิจที่มีต่อการเจริญเติบโตทางเศรษฐกิจของไทย การสร้างสายพันธุ์ Bacillus thuringiensis subsp. aizawai ที่ผลิตเอนไซม์ไคติเนสในระยะเซลล์สร้างสปอร์ การสกัดและการศึกษาคุณสมบัติของ recombinant dengue envelope protein ที่ผลิตได้จาก Baculovirus Expression Insect Cell Systems สัณฐานวิทยาและคาริโอไทป์ของสุนัขไทยพันธุ์บางแก้ว และสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้อง
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair