| บทคัดย่อ: |
โครงการวิจัยปีที่ 3 นี้ได้รวบรวมและคัดเลือกคัมภีร์ตำรับยาสมุนไพรจากภาคเหนือ/ล้านนาและภาคอื่นๆในประเทศไทย แล้วนำมาปริวรรต (แปล) เพื่อจัดทำฐานข้อมูลสนับสนุน: ตำรับยาสมุนไพรต้านมะเร็ง “ฐานข้อมูลคัมภีร์ตำรายาสมุนไพรของประเทศไทยมโนสร้อย ๓” โดยได้ตำรับยาสมุนไพรเพิ่มจากโครงการวิจัยปีที่ 2 อีกจานวน 36 ตารับ เป็นรวมทั้งสิ้น 723 ตารับ โดยสามารถสืบค้นจากคำสำคัญ 2 คำ ซึ่งได้แก่ สาน และมะเร็ง จากนั้นคัดเลือกตำรับยาสมุนไพรที่มีศักยภาพในการต้านมะเร็งโดยใช้ความถี่ ได้ตำรับยาสมุนไพรต้านมะเร็ง ทั้งนี้ในปี 3 ที่มีตำรับยาสมุนไพรต้านมะเร็งที่จะต้องทำการศึกษาเพิ่มเติมจากปีที่ 2 อีกจำนวน 20 ตำรับ รวมทั้งสิ้น 191 ตำรับ มาเตรียมเป็นสารสกัดโดยวิธีการที่ระบุในตารับ จากผลการเตรียมสารสกัดพบว่า percentage yield อยู่ในช่วง 10.45– 41.00 % สารสกัดที่ได้ส่วนใหญ่ให้ผลบวกกับสารประเภท glycosides, tannins, flavonoids และ xanthones จากนั้นนำสารสกัดตำรับยาสมุนไพรที่เตรียมได้ไปทดสอบฤทธิ์ต้านมะเร็ง 4 ชนิด ในหลอดทดลองโดยวิธี sulforhodamine B (SRB) assay ซึ่งได้แก่ มะเร็งช่องปาก (KB) มะเร็งปากมดลูก (HeLa) มะเร็งลำไส้ใหญ่ (HT-29) และ มะเร็งตับ (Hep G2) พบว่า ตำรับยาสมุนไพรที่คัดเลือกเพิ่มเติมทั้ง 20 ตำรับ ไม่มีฤทธิ์ในการยับยั้งการเจริญของเซลล์มะเร็งช่องปาก (KB) มะเร็งปากมดลูก (HeLa) มะเร็งลำไส้ใหญ่ (HT-29) และมะเร็งตับ (Hep G2) โดยมีค่า IC50 มากกว่า 1,000 μg/ml อย่างไรก็ตาม เมื่อนำผลการทดสอบดังกล่าวมาพิจารณาร่วมกับผลการทดสอบของสารสกัดตำรับยาสมุนไพรที่คัดเลือกมาแล้วจานวน 171 ตำรับในโครงการวิจัยปีที่ 1 และ 2 เป็นรวมจำนวนทั้งสิ้น 191 ตารับ พบว่าตำรับ อส028 น040 น092 และ น036 เป็นตำรับที่สามารถยั้บยั้งเซลล์มะเร็งช่องปาก มะเร็งปากมดลูก มะเร็งลำไส้ใหญ่และมะเร็งตับได้สูงสุด ตามลาดับ ตำรับดังกล่าวนี้มีศักยภาพสูงสุดที่จะสามารถนำไปพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ตำรับยาสมุนไพรไทยต้านมะเร็งต่อไป ในการเตรียมสารสกัดจากตำรับสมุนไพรต้านมะเร็งที่คัดเลือกมาจานวน 4 ตารับ พบว่า percentage yield อยู่ในช่วง 6.43–19.50 % จากการทดสอบฤทธิ์กระตุ้นการตายของเซลล์มะเร็งแบบอะพอพโตซิสของสารสกัดตำรับยาสมุนไพรต้านมะเร็งที่คัดเลือกมาโดยวิธีย้อมสีผสม acridine orange และ ethidium bromide (AO/EB) พบว่า สารสกัดตำรับ อส028 น040 น092 และ น036 สามารถกระตุ้นการตายแบบอะพอพโทซิสได้ในเซลล์มะเร็งทั้ง 4 ชนิด ซึ่งได้แก่ เซลล์มะเร็งช่องปาก (KB) มะเร็งปากมดลูก (HeLa) มะเร็งลำไส้ใหญ่ (HT-29) และมะเร็งตับ (Hep G2) โดยมีค่า maximum apoptosis เท่ากับ 16.95, 2.65, 5.33 และ 4.57 % ตามลำดับ ซึ่งมีความแรงคิดเป็น 1.8606, 0.7615, 1.9453 และ 1.5083 เท่าของยามาตรฐาน cisplatin ตามลาดับ นอกจากนี้สารสกัดตำรับยาทั้ง 4 ตำรับดังกล่าว ยังสามารถกระตุ้นการตายแบบอะพอพโตซิสต่อเซลล์มะเร็งโดยมีผลในการกระตุ้นการทำงานของเอนไซม์ caspase-3 โดยสารสกัดตำรับ อส028 น040 น092 และ น036 มีค่า fold increasing ต่อเซลล์มะเร็ง KB, HeLa, HT-29 และ Hep G2 เท่ากับ 1.63, 1.21, 2.87 และ 1.21 เท่าของกลุ่มควบคุมตามลาดับ ซึ่งมีฤทธิ์กระตุ้น การตายแบบอะพอพโตซิสคิดเป็น 1.52, 1.05, 2.33 และ 1.05 เท่าของยามาตรฐาน cisplatin ในการศึกษาสมบัติทางเคมีและกายภาพและจัดทา specification ของสารสกัดจากตำรับยาสมุนไพรต้านมะเร็งที่คัดเลือกมาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ พบว่าสารสกัดตารับ อส028, น040 และ น092 สามารถละลายในน้ำได้แบบ sparingly soluble ในขณะที่สารสกัดตารับยาสมุนไพร น036 ละลายในน้าได้แบบ slightly soluble สารสกัดทั้ง 4 ตำรับ ไม่คงตัวต่อ เบสแก่และ reducing agent เมื่อนำสารสกัดตำรับยาที่คัดเลือกมาทั้ง 4 ตารับ ไปศึกษาความปลอดภัยและฤทธิ์ต้านมะเร็งในสัตว์ทดลองพบว่า สารสกัดตารับยา น040 อส028 น092 และ น036 มีความปลอดภัยในสัตว์ทดลองโดยไม่พบสัตว์ทดลองตายและไม่มีอาการผิดปกติในระหว่างการทดสอบความเป็นพิษแบบกึ่งเรื้อรัง (subchronic toxicity) รวมทั้งมีผลการตรวจวิเคราะห์ทางโลหิตวิทยาและชีวเคมีอยู่ในเกณฑ์ปกติ สาหรับพยาธิสภาพของอวัยวะภายในของสัตว์ทดลอง พบว่าสารสกัดตารับสมุนไพรทาให้มีความเป็นพิษต่อบางอวัยวะซึ่งได้แก่ ปอด ตับ ไต และ ลาไส้เล็ก อย่างไรก็ตาม เนื่องจากขนาดของสารสกัดตารับยาสมุนไพรดังกล่าวที่ใช้ในการทดสอบมีขนาดค่อนข้างสูง (1,000 mg/kg body weight) ซึ่งมีขนาดสูงกว่าขนาดยาที่ใช้ในการรักษาของสารสกัดตารับยา น040 อส028 น092 และ น036 ประมาณ 112, 186, 61 และ 109 เท่า ตามลาดับ ดังนั้น สารสกัดตารับยาดังกล่าวจึงมีความปลอดภัยในสัตว์ทดลองและสามารถนาไปพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ยาต้านมะเร็งเพื่อใช้รักษาผู้ป่วยโรคมะเร็งต่อไป สาหรับผลการศึกษาฤทธิ์ต้านมะเร็งในสัตว์ทดลองโดยวิธี human tumor xenograft พบว่าสารสกัดตำรับยาสมุนไพรรักษาโรคมะเร็ง ตารับ น040 อส028 และ น092 สามารถออกฤทธิ์ต้านเซลล์มะเร็งปากมดลูก (HeLa) มะเร็งช่องปาก (KB) และมะเร็งลาไส้ใหญ่ (HT-29) ได้ โดยมีค่า % maximum inhibition ของตารับ น040 และ อส028 เท่ากับ 57.23 และ 49.26% ตามลำดับ ซึ่งมีความแรงคิดเป็น 0.65 และ 0.69 เท่าของยามาตรฐาน cisplatin ตามลาดับและค่า %maxinum inhibition ของตารับ น092 เท่ากับ 77.90% ซึ่งมีความแรงคิดเป็น 1.76 เท่าของมาตรฐาน 5-fluorouracil โดยสารสกัดตำรับยาดังกล่าวมีความปลอดภัยในการนำไปใช้เนื่องจากไม่พบว่ามีการตาย การเปลี่ยนแปลงของน้ำหนักและไม่มีผลข้างเคียงในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสารสกัดตำรับยาดังกล่าว ดังนั้น ตำรับยาสมุนไพรรักษาโรคมะเร็งทั้ง 3 ตำรับ จึงมีศักยภาพสูงในการพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ต้านมะเร็งปากมดลูก มะเร็งช่องปาก และมะเร็งลำไส้ใหญ่ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากเซลล์มะเร็งตับ (Hep G2) ไม่มีคุณสมบัติเหนี่ยวนาให้เกิดก้อนมะเร็ง จึงไม่สามารถนามาศึกษาฤทธิ์ต้านมะเร็งตับของตำรับยา น036 ในสัตว์ทดลองได้ อย่างไรก็ตาม ตำรับยา น036 ยังคงมีศักยภาพสูงในการพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ต้านมะเร็งตับ เนื่องจากตารับยาดังกล่าวมีฤทธิ์ต้านเซลล์มะเร็งตับ (Hep G2) ในหลอดทดลองสูงสุดและสามารถกระตุ้นให้เซลล์มะเร็งตับเกิดการตายแบบอะพอพโตซิส ตลอดจนมีความปลอดภัยในสัตว์ทดลอง ดังนั้นจึงได้คัดเลือกสารสกัดตารับทั้ง 4 ตารับดังกล่าว ไปพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์รูปแบบแคปซูลจากสารสกัดตารับยาสมุนไพรไทยต้านมะเร็งที่อยู่ในรูปแกรนูลโดยใช้ lactose monohydrate และ Comprecel M101 เป็นสารเพิ่มปริมาณ โดยไม่ใช้สารยึดเกาะ ตำรับแคปซูลทั้ง 4 ตำรับ ที่พัฒนาได้มีค่าการแปรปรวนของน้าหนักและการแตกตัวอยู่ในเกณฑ์ที่กาหนด รวมถึงมีความคงตัวของปริมาณสารสาคัญ ซึ่งได้แก่ tannin สาหรับสารสกัดตำรับ อส028 และ brazilin สาหรับสารสกัดตารับ น040 และ น036 และ gallic acid สาหรับสารสกัดตำรับ น092 เมื่อเก็บไว้ในสภาวะต่างๆ ที่ 4+2, 25+2 และ 45+2 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 3 เดือน จากการประเมินความพึงพอใจผลิตภัณฑ์แคปซูลที่มีส่วนผสมของสารสกัดตำรับยาสมุนไพรต้านมะเร็งในอาสาสมัคร พบว่า อาสาสมัครส่วนใหญ่ มีความพึงพอใจในลักษณะภายนอกของแกรนูลของผลิตภัณฑ์แคปซูลจากสารสกัดตารับยาสมุนไพรทั้ง 4 ตารับ คณะผู้วิจัยได้คัดเลือกผลิตภัณฑ์แคปซูลสาร สกัดตำรับยาสมุนไพรรักษาโรคมะเร็งตำรับ น040 ไปทดสอบในผู้ป่วยโรคมะเร็งปากมดลูก ที่ดำเนินการโดยกรมพัฒนาการแพทย์แผนไทยและการแพทย์ทางเลือก กระทรวงสาธารณสุข เนื่องจากสารสกัดตารับยาดังกล่าวมีฤทธิ์ต้านมะเร็งปากมดลูก (HeLa) ในหลอดทดลองและสัตว์ทดลอง และมีความปลอดภัยในสัตว์ทดลอง ตลอดจนผลิตภัณฑ์แคปซูลจากสารสกัดตำรับยาดังกล่าวมีความคงตัวทางกายภาพและเคมีโดยมีปริมาณสารสาคัญซึ่งได้แก่ brazilin คงเหลือมากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับตำรับอื่นหลังจากเก็บไว้ที่อุณหภูมิต่างๆ เป็นเวลา 3 เดือน สาหรับต้นทุนการผลิตของสารสกัดตำรับยาสมุนไพรรักษาโรคมะเร็ง น040 มีค่าเท่ากับ 315.90 บาท/100 g ในขณะที่ต้นทุนการผลิตผลิตภัณฑ์ยาสมุนไพรรักษาโรคมะเร็งในรูปแบบแคปซูลจากสารสกัดตำรับยาสมุนไพร น040 มีค่าเท่ากับ 206.59 บาท/ 100 แคปซูล หรือ 2.07 บาท ต่อ 1 แคปซูล โดยสารสกัดตารับยาสมุนไพร น040 และผลิตภัณฑ์ยาแคปซูลจากสารสกัดตารับยาสมุนไพร น040 สามารถเพิ่มมูลค่าของสมุนไพรที่เป็นองค์ประกอบในตารับได้ประมาณ 24 เท่าเมื่อเทียบกับสารสกัดมีราคาถูกกว่า Taxol® ประมาณ 30 เท่า จากผลการวิจัยดังกล่าว คณะผู้วิจัยยื่นจดสิทธิบัตรเรื่อง “ผลิตภัณฑ์และกระบวนการผลิตผลิตภัณฑ์เพื่อรักษาโรคมะเร็งรูปแบบรับประทานจากตารับยาสมุนไพรไทย” โดยขณะนี้อยู่ในขั้นตอนการยื่นขอจด และ ได้ตีพิมพ์บทความวิจัยเรื่อง “Potent anti-cervical cancer activity: Synergistic effects of Thai medicinal plants in recipe N040 selected from the MANOSROI III database” แล้วในวารสารวิชาการระดับนานาชาติ Journal of Ethnopharmacology, 143(2013) : 288-296 (Impact factor = 2.939) จากผลการวิจัยนี้ สามารถสรุปได้ว่าตารับยาสมุนไพรไทยต้านมะเร็งจากฐานข้อมูล “มโนสร้อย 3” มีศักยภาพสูงที่จะสามารถนามาพัฒนาเป็นผลิตภัณฑ์ยาต้านมะเร็งได้ |
| บทคัดย่อ (EN): |
The Thai medicinal plant anti-cancer recipes from the Lanna region and all over Thailand were
collected, translated and recorded in the Thai medicinal plant anti-cancer recipe database MANOSROI III.
At present, this database increased from 36 to 723 anti-cancer recipes. The keywords for cancer “San” and
“Ma-reng” were used to select the anti-cancer recipes. The recipes selected from the “MANOSROI III”
database increased from 20 to 191 recipes. The 20 medicinal plant recipes from the research project in this
phase (the third year) were extracted using the method indicated in the recipe. The percentage yields of the
20 recipe extracts were in the range of 10.45-41.00 %. Glycosides, tannins, flavonoids and xanthones were
the most abundant phytochemicals found in the extracts. Anti-proliferative activity of 20 recipes on 4
cancer cell lines including human mouth epidermal carcinoma (KB), human cervical adenocarcinoma
(HeLa), human colon adenocarcinoma (HT-29) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) were
investigated by the sulforhodamine B (SRB) assay. The 20 recipe extracts gave inactive anti-proliferative
activity on KB, HeLa, HT-29 and Hep G2 with the IC50 values more than 100 µg/ml. From the antiproliferative activity of the 191 recipe extracts collected from the research project of the 1st to the 3rd
year,
the extracts of recipe NE028, N040, N092 and N036 showed the highest anti-proliferative activity against
KB, HeLa, HT-29 and Hep G2, respectively. This has demonstrated the potential of these recipes for the
further development as the anti-cancer herbal drugs. The percentage yields of the 4 selected recipe extracts
were in the range of 6.43-19.50 %. The extracts of the 4 recipes were further examined for apoptotic
activity by acridine orange and ethidium bromide (AO/EB) staining method. The extracts of recipes
NE028, N040, N092 and N036 demonstrated the apoptosis induction on KB, HeLa, HT-29 and Hep G2,
respectively with the maximum apoptosis of 16.95, 2.65, 5.33 and 4.57 %, respectively which were
1.8606, 0.7615, 1.9453 and 1.5083 folds of cisplatin. Moreover, the apoptosis induction on KB, HeLa,
HT-29 and Hep G2 via caspase-3 activation was observed in the extracts of recipes NE028, N040, N092
and N036, respectively. The increasing folds of recipes NE028, N040, N092 and N036 were 1.63, 1.21,
2.87 and 1.21, respectively which were 1.52, 1.05, 2.33 and 1.05 folds of cisplatin. Physicochemical
properties of the 4 selected recipe extracts were performed in order to standardize and establish their
specifications. The extracts of recipes NE028, N040 and N092 were sparingly soluble in water, whereas
that of recipe N036 was slightly soluble in water. All recipe extracts were unstable in strong basic (NaOH)
and reducing agent (FeCl3
). Safety evaluation and anti-cancer activity in animals of the 4 selected recipe
extracts were investigated. In the subchronic toxicity study, recipies N040, NE028, N092 and N036
indicated no mortality, abnormal animal behaviors and toxic signs in rats, and also no alteration in
hematology and clinical blood chemistry. Only minor lesions of some organs including lung, liver, kidney
and small intestine were observed. However, the minor toxicity of the extracts might be due to the high
dose (1,000 mg/kg body weight) of N040, NE028, N092 and N036 used in the study, which was about
112, 186, 61 and 109 folds of the normal traditional dose, respectively. These results indicated the safety
of N040, NE028, N092 and N036 recipe for the further development as anti-cancer herbal drugs for
cancer patients. The in vivo anti-cancer activity of the 4 selected recipe extracts was investigated using the
human tumor xenograft. The recipies N040 and NE028 and N092 demonstrated anti-tumor activity against
HeLa, KB and HT-29 respectively. The percentages of maximum inhibition of recipies N040, NE028 and
N092 were 57.23 % (0.65 fold of cisplatin), 49.26 % (0.69 fold of cisplatin) and 77.90 % (1.76 folds of 5-
fluorouracil), respectively. There were no mortality, weight loss and noticeable major side effects of the
animals treated with the extracts at all doses of the N040, NE028 and N092 extracts, cisplatin and 5-
fluorouracil. This has demonstrated the potential of these recipes for the further development as herbal
drugs for cervical, mouth and colorectal cancers. Due to the lack of tumorigenicity of Hep G2 cell line, in
the in vivo anti-cancer activity of recipe N036 on Hep G2 cannot be performed. However, the recipe N036
which showed the highest anti-proliferative and apoptotic activities with safety in rats was still selected
for the further development of the herbal drug product for liver cancer. Therefore, the extracts of recipes
N040, NE028, N092 and N036 were prepared as the capsule dosage forms. Granules of the 4 recipe
extracts were prepared using lactose monohydrate and Comprecel M101 as diluents and water as a binder.
The developed N040, NE028, N092 and N036 capsules passed the quality control of weight variation and
disintegration. The active constituents including tannin (for NE028) and brazilin (for N040 and N036) and
gallic acid (for N092) in the developed capsules were stable in various conditions at 4+2, 25+2 and
45+2C for 3 months. In the satisfaction study in volunteers, most volunteers satisfied the physical
appearance of the developed N040, NE028, N092 and N036 capsules. Since the recipe N040 indicated the
in vitro and in vivo anti-cancer activities on HeLa with safety in rats and gave the highest stability of
active constituent (brazilin) after stored in various conditions for 3 months. The developed N040 capsules
were selected for efficacy study in cervical cancer patients. This clinical study has been performed by the
Department for Development of Thai Traditional and Alternative Medicine, Ministry of Public Health in
Thailand. The production cost of the recipe N040 extract and the developed N040 capsules were 315.90
baht/100 g and 206.59 baht/100 capsules or 2.07 baht/capsule respectively. The average values of the
extracts were 24 folds of the medicinal plants composing in the recipe. The cost of the developed N040
capsules was cheaper than Taxol®
of 30 folds. Therefore, the N040 extract and capsules improved the
values of the medicinal plants composing in the recipe. From the results of the project, the patent entitled
“Products and production process of the anti-cancer herbal drugs from the Thai medicinal plant recipes”
has been prepared and submitted which is in the registration process. The research article entitled “Potent
anti-cervical cancer activity: Synergistic effects of Thai medicinal plants in recipe N040 selected from the
MANOSROI III database” has been published in Journal of Ethnopharmacology 149 (2013), 288-296
(Impact factor = 2.939). Finally, this study has indicated the potential of the Thai medicinal plant recipe
from the “MANOSROI III” database for the further development as anti-cancer herbal drugs. |
