สืบค้นงานวิจัย
การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter Lwoffii และความเป็นไปได้ในการผลิตกรดอะมิโน
Parkpoom Sitthai - จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
ชื่อเรื่อง: การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter Lwoffii และความเป็นไปได้ในการผลิตกรดอะมิโน
ชื่อเรื่อง (EN): Cloning and expression of phenylalanine dehydrogenase gene from Acinetobacter lwoffii and the possibility for amino acid production
ผู้แต่ง / หัวหน้าโครงการ (EN): Parkpoom Sitthai
บทคัดย่อ: ฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส (EC 1.4.1.20) เป็นเอนไซม์ในกลุ่มอะมิโนแอซิดดีไฮโดรจิเนสเร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากแอล-ฟีนิลอะลานีนให้ผลิตภัณฑ์เป็นฟีนิลไพรูเวทและแอมโมเนีย โดยเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้ที่มีไพริดีนนิวคลีโอไทด์เป็นโคเอนไซม์ กลุ่มวิจัยของเราได้ศึกษาฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter lwoffii และพบว่านอกจากใช้แอล-ฟีนิลอะลานีนเป็นสับสเตรทแล้ว ยังสามารถใช้แอลเมไธโอนีน แอล-ทริปโตเฟน และแอล-นอร์ลูซีนเป็นสับสเตรทสำหรับปฏิกิริยา oxidative deamination ได้ด้วย นอกจากนั้นยังพบว่าเอนไซม์นี้ไม่สูญเสียแอคติวิตีเมื่อบ่มที่ 55 องศาเซลเซียสที่ pH 7.4 เป็นเวลา 10 นาที ด้วยเหตุนี้จึงอาจเป็นไปได้ที่จะใช้ฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก A.lwoffii เพื่อผลิตกรดอะมิโนรูปแบบแอลชนิดต่างๆ เนื่องจากมีการศึกษานิวคลีโอไทด์ของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส จาก A. lwoffii ไว้แล้ว ดังนั้นงานวิจัยครั้งนี้จึงทำการโคลนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส จาก A. lwoffii เข้าสู่ E. coli BL21(DE3) และ E. coli BL21(DE3)pLysS โดยใช้ expression vector (pET-17b) เมื่อวิเคราะห์สารละลายเอนไซม์หยาบที่ได้จากรีคอมบีแนนท์โคลน พบว่าเอนไซม์มีค่าแอคติวิตีจำเพาะอยู่ในช่วง 0.81-4.46 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนแอคติวิตีจำเพาะสูงสุดของโคลนที่ได้มากกว่าแอคติวิตีจำเพาะจาก A. lwoffii 55.75 เท่า ภาวะที่เหมาะสมในการเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสคือ เหนี่ยวนำด้วย IPTG 0.4 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 8 ชั่วโมง การทดสอบความเสถียรของการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสในเซลล์เจ้าบ้าน E. coli BL21(DE3) โดยเพาะเชื้อต่อช่วงโคลนที่มีแอคติวิตีของเอนไซม์สูงสุดวันต่อวันเป็นเวลา 20 วัน พบว่าการเพาะเชื้อต่อช่วงมีผลให้การแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสลดลง เมื่อนำเอนไซม์มาทำให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต และแยกโดยโครโมโตกราฟฟีคอลัมน์ดีอีเออีโทโยเพิร์ล พบว่ามีแอคติวิตีคงเหลือ 29.45 เปอร์เซ็นต์ และบริสุทธิ์ขึ้น 5.19 เท่า ในปฏิกิริยา oxidative deamination เอนไซม์มีความจำเพาะสูงมากต่อแอล-ฟีนิลอะลานีน ส่วน reductive amination เอนไซม์มีความจำเพาะต่อ alpha-ketocaproate, alpha-keto-gamma-methiol-n-butyrate, alpha-ketovalerate และ alpha-ketoisocaproate สูงกว่าฟีนิลไพรูเวท 5.96, 4.12, 3.84 และ 3.15 เท่า ตามลำดับ เอนไซม์ไม่สูญเสียแอคติวิตีเมื่อบ่มที่ 30 องศาเซลเซียส pH 9.5 เป็นเวลา 4 ชั่วโมง และยังคงมีแอคติวิตีเหลืออยู่ 50 เปอร์เซ็นต์ เมื่อบ่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมง เมื่อนำเอนไซม์ไปใช้ผลิตกรดอะมิโนรูปแบบเอลชนิดต่างๆ จากสับสเตรทที่เป็นกรดคีโต พบว่าได้ผลผลิตในช่วง 36.0-72.2 เปอร์เซ็นต์
บทคัดย่อ (EN): Phenylalanine dehydrogenase (EC 1.4.1.20), one of amino acid dehydrogenases, catalyzes the reversible pyridine nucleotide -dependent oxidative deamination of L-phenylalanine to form ammonia, phenylpyruvate, and NADH. Our research group has studied phenylalanine dehydrogenase from Acinetobacter lwoffii and found that L-methionine, L-tryptophan and L-norleucine could act as substrate in the oxidative deamination of the enzyme. No loss of the enzyme activity was observed upon incubation at 55 ํC, pH 7.4 for 10 minutes. From these properties, the enzyme seems to have more potential in the synthesis of various amino acids. Moreover, nucleotide sequence of phenylalanine dehydrogenase gene from A. lwoffii was already determined. Thus, in this research the phenylalanine dehydrogenase gene was cloned and expressed in E. coli BL21(DE3) and E. coli BL21(DE3)pLysS host cells using expression vector, pET-17b. The specific activity from crude extract of recombinant clones were found in the range of 0.81 4.46 units/mg protein. The highest specific activity was 55.75 fold higher than that of the enzyme from A. lwoffii. The optimum condition for phenylalanine dehydrogenase gene expression was induction with 0.4 mM IPTG for 8 hours. Stability of phenylalanine dehydrogenase gene expression in E. coli BL21(DE3) was studied. After daily subculture the recombinant clone showed the highest phenylalanine dehydrogenase activity for 20 days, it was found that phenylalanine dehydrogenase activity decreased with the increasing number of subculture. The enzyme was purified to homogeneity by 50-70 % saturated ammonium sulfate precipitation and DEAE-Toyopearl column chromatography with 29.45 % yield and 5.19 purification fold. The enzyme showed high substrate specificity in the oxidative deamination on L-phenylalanine while it acted on alpha-ketocaproate, alpha-keto-gamma-methiol-n-butyrate, alpha-ketovalerate and alpha-ketoisocaproate with 5.96, 4.12, 3.84 and 3.15 fold of its natural substrate, phenylpyruvate, respectively in reductive amination. No loss of enzyme activity was observed upon incubation at 30 ํC, pH 9.5 for 4 hours and 50 % of the activity was retained after incubation at this temperature for 12 hours. When phenylalanine dehydrogenase was used for production of amino acids using their corresponding keto acids as substrates, the product yield was in the range between 36.0-72.2 %
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เอกสารแนบ: http://thailis-db.car.chula.ac.th/CU_DC/Thesis/February2006/Parkpoom.pdf
เผยแพร่โดย: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
คำสำคัญ (EN): Dehydrogenass
เจ้าของลิขสิทธิ์: จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
รายละเอียด: ฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส (EC 1.4.1.20) เป็นเอนไซม์ในกลุ่มอะมิโนแอซิดดีไฮโดรจิเนสเร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากแอล-ฟีนิลอะลานีนให้ผลิตภัณฑ์เป็นฟีนิลไพรูเวทและแอมโมเนีย โดยเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้ที่มีไพริดีนนิวคลีโอไทด์เป็นโคเอนไซม์ กลุ่มวิจัยของเราได้ศึกษาฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter lwoffii และพบว่านอกจากใช้แอล-ฟีนิลอะลานีนเป็นสับสเตรทแล้ว ยังสามารถใช้แอลเมไธโอนีน แอล-ทริปโตเฟน และแอล-นอร์ลูซีนเป็นสับสเตรทสำหรับปฏิกิริยา oxidative deamination ได้ด้วย นอกจากนั้นยังพบว่าเอนไซม์นี้ไม่สูญเสียแอคติวิตีเมื่อบ่มที่ 55 องศาเซลเซียสที่ pH 7.4 เป็นเวลา 10 นาที ด้วยเหตุนี้จึงอาจเป็นไปได้ที่จะใช้ฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก A.lwoffii เพื่อผลิตกรดอะมิโนรูปแบบแอลชนิดต่างๆ เนื่องจากมีการศึกษานิวคลีโอไทด์ของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส จาก A. lwoffii ไว้แล้ว ดังนั้นงานวิจัยครั้งนี้จึงทำการโคลนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนส จาก A. lwoffii เข้าสู่ E. coli BL21(DE3) และ E. coli BL21(DE3)pLysS โดยใช้ expression vector (pET-17b) เมื่อวิเคราะห์สารละลายเอนไซม์หยาบที่ได้จากรีคอมบีแนนท์โคลน พบว่าเอนไซม์มีค่าแอคติวิตีจำเพาะอยู่ในช่วง 0.81-4.46 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีนแอคติวิตีจำเพาะสูงสุดของโคลนที่ได้มากกว่าแอคติวิตีจำเพาะจาก A. lwoffii 55.75 เท่า ภาวะที่เหมาะสมในการเหนี่ยวนำให้เกิดการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสคือ เหนี่ยวนำด้วย IPTG 0.4 มิลลิโมลาร์เป็นเวลา 8 ชั่วโมง การทดสอบความเสถียรของการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสในเซลล์เจ้าบ้าน E. coli BL21(DE3) โดยเพาะเชื้อต่อช่วงโคลนที่มีแอคติวิตีของเอนไซม์สูงสุดวันต่อวันเป็นเวลา 20 วัน พบว่าการเพาะเชื้อต่อช่วงมีผลให้การแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสลดลง เมื่อนำเอนไซม์มาทำให้บริสุทธิ์โดยการตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต และแยกโดยโครโมโตกราฟฟีคอลัมน์ดีอีเออีโทโยเพิร์ล พบว่ามีแอคติวิตีคงเหลือ 29.45 เปอร์เซ็นต์ และบริสุทธิ์ขึ้น 5.19 เท่า ในปฏิกิริยา oxidative deamination เอนไซม์มีความจำเพาะสูงมากต่อแอล-ฟีนิลอะลานีน ส่วน reductive amination เอนไซม์มีความจำเพาะต่อ alpha-ketocaproate, alpha-keto-gamma-methiol-n-butyrate, alpha-ketovalerate และ alpha-ketoisocaproate สูงกว่าฟีนิลไพรูเวท 5.96, 4.12, 3.84 และ 3.15 เท่า ตามลำดับ เอนไซม์ไม่สูญเสียแอคติวิตีเมื่อบ่มที่ 30 องศาเซลเซียส pH 9.5 เป็นเวลา 4 ชั่วโมง และยังคงมีแอคติวิตีเหลืออยู่ 50 เปอร์เซ็นต์ เมื่อบ่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมง เมื่อนำเอนไซม์ไปใช้ผลิตกรดอะมิโนรูปแบบเอลชนิดต่างๆ จากสับสเตรทที่เป็นกรดคีโต พบว่าได้ผลผลิตในช่วง 36.0-72.2 เปอร์เซ็นต์
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Parkpoom Sitthai. "การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter Lwoffii และความเป็นไปได้ในการผลิตกรดอะมิโนCloning and expression of phenylalanine dehydrogenase gene from Acinetobacter lwoffii and the possibility for amino acid production". จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. 2547

Parkpoom Sitthai. "การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter Lwoffii และความเป็นไปได้ในการผลิตกรดอะมิโนCloning and expression of phenylalanine dehydrogenase gene from Acinetobacter lwoffii and the possibility for amino acid production". จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย. 2547. Print.



TARR Wordcloud:
การโคลนและการแสดงออกของยีนฟีนิลอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Acinetobacter Lwoffii และความเป็นไปได้ในการผลิตกรดอะมิโน
Parkpoom Sitthai
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
2547
การปรับปรุงความเสถียรต่อความร้อนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromanas hydrophila โดยวิธี site directed mutagenesis การศึกษาในโคลนและการแสดงออกของยีนที่ควบคุมเอนไซ การโคลนและการแสดงออกของยีนไคติเนสที่แยกได้จาก Beauveria bassiana ใน Escherichia Coli การทำให้บริสุทธิ์และลักษณะสมบัติของลูซีนดีไฮโดรจิเนส จาก Alcaligenes faecalis ผลของแคดเมียมต่อโปรตีนจีเอพีดีเอชและการแสดงออกของยีนนีโมในส่วนที่มีความสัมพันธ์กับยีนของเอ็นไซม์จี-6-พีดีในเซลล์เฮปจี2 การวิเคราะห์การกลายพันธุ์และแฮปโปลทัยป์ของยีนสร้างกลูโคส - 6 -ฟอสเฟต ดีไฮโดรจีเนสในประชากรเอเซียตะวันออกเฉียงใต้ การศึกษาคุณสมบัติของยีนมะเร็งของไวรัส HPV16 : ความหลากหลายของยีน แหล่งที่อยู่และหน้าที่การกระตุ้นการแสดงออกของยีน การตรวจหาการแสดงออกที่ต่างกันของยีนในใบประดับของบัวชั้นโดยเทคนิคดีดีอาร์ที-พีซีอาร์ การโคลนยีนการแสดงออกและคุณสมบัติทางชีววิทยาของโปรตีนที่มีฤทธิ์ยับยั้งไรโบโซมประเภทที่ การผลิตเอนไซม์ cytochrome P450 2C8 โดยใช้แบคทีเรียและการศึกษาบทบาทของกรดอะมิโนบางตำแหน่งในส่วนเร่งป
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair