| บทคัดย่อ: |
การถ่ายยีนเข้าสู่พืชมีหลายปัจจัยเข้ามาเกี่ยวข้อง การพัฒนาระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เหมาะสมเป็นปัจจัยหนึ่งที่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการถ่ายยีน โดยการศึกษานี้ได้ทำการศึกษาผลของชิ้นส่วนพืช สูตรอาหาร และสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมาะสมกับการชักนำแคลลัสในต้นสัก พบว่าการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนฐานใบต้นสักในอาหารสูตร MS ที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต NAA 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ BA 0.6 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำแคลลัสของต้นสักได้ดี แคลลัสที่ได้มีลักษณะเป็นแคลลัสแบบเกาะกันแน่น สีเหลืองอ่อน
ในการถ่ายยีนเข้าสู่พืชนิยมถ่ายยีนเครื่องหมายคัดเลือก เช่นยีนต้านทานสารปฏิชีวนะเข้าสู่พืชพร้อมกับยีนที่ต้องการ ซึ่งการใช้สารปฏิชีวนะในการคัดเลือกที่ไม่เหมาะสมจะมีผลต่อประสิทธิภาพการถ่ายยีนและการพัฒนาของเนื้อเยื่อ ดังนั้นในการศึกษานี้จึงทดสอบผลของสารปฏิชีวนะ hygromycin ความเข้มข้น 0, 3, 5, 10 และ 20 มิลลิกรัมต่อลิตร ที่มีต่อการเจริญของเนื้อเยื่อฐานใบ และข้อของต้นสักจำนวน 3 สายต้นคือ 26C33 22C53 และ16C7 ในสภาพปลอดเชื้อ เป็นระยะเวลา 5 สัปดาห์ พบว่าอาหารคัดเลือกที่เติม hygromycin ความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นระดับที่สามารถกำจัดชิ้นส่วนที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนได้ สำหรับการทดสอบสารปฏิชีวนะ cefotaxime ความเข้มข้น 0, 200, 250, 300, 350 และ 400 มิลลิกรัมต่อลิตร ต่อประสิทธิภาพในการกำจัดเชื้อส่วนเกิน และผลต่อการเกิดแคลลัสของเนื้อเยื่อต้นสัก พบว่าการใช้ cefotaxime ที่ความเข้มข้น 250-300 มิลลิกรัมต่อลิตรมีประสิทธิภาพสูงในการยับยั้งการเจริญเติบโตของ Agrobacterium tumefaciens และชิ้นส่วนต้นสักสามารถพัฒนาเกิดแคลลัสได้ ส่วนการคัดเลือกด้วยสารไกลโฟเสท พบว่าจาก การทดสอบสารความเข้มข้น 1-10 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้นที่ 1 มิลลิโมลาร์ดีที่สุด สามารถกำจัดชิ้นส่วนที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนได้ทั้งหมด
เทคนิคการถ่ายยีนเข้าสู่เนื้อเยื่อพืชโดยใช้เครื่องยิงอนุภาคเป็นวิธีที่นิยมใช้อย่างแพร่หลายและมีประสิทธิภาพ เนื่องจากเป็นวิธีที่ง่ายและใช้ถ่ายยีนเข้าสู่จีโนมพืชได้หลายชนิด จากการศึกษาปัจจัยที่เกี่ยวกับการถ่ายยีนต้านทานต่อสารกำจัดวัชพืชไกลโฟเสท (aroA) ในชิ้นส่วนข้อ และฐานใบต้นสัก ได้แก่แรงดันก๊าซฮีเลียมที่ใช้ในการขับเคลื่อนอนุภาคเข้าสู่เนื้อเยื่อเป้าหมายที่ระดับ 900 1,100 และ 1,200 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว ระยะห่างระหว่างแท่นหยุดอนุภาคกับเนื้อเยื่อเป้าหมายที่ 6 9 และ 12 เซนติเมตร ตรวจสอบการแสดงออกของยีน gus แบบชั่วคราวโดยวิธี GUS histochemical assay พบว่าไม่มีชิ้นส่วนต้นสักที่ติดสีน้ำเงิน จึงต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อให้เกิดประสิทธิภาพในการถ่ายยีนต้านทานสารกำจัดวัชพืชไกลโฟเสทเข้าสู่ต้นสักด้วยเครื่องยิงอนุภาค
สำหรับการศึกษาปัจจัยที่มีผลต่อประสิทธิภาพการถ่ายยีนโดยใช้อโกรแบคทีเรียมเป็นพาหะได้ทำการทดสอบ 6 ปัจจัย คือ สายพันธุ์เชื้ออโกรแบคทีเรียม และความเข้มข้นของเชื้อ ชิ้นส่วนพืช การสร้างบาดแผล และระยะเวลาในการปลูกเชื้อและเลี้ยงร่วม จากการเปรียบเทียบประสิทธิภาพของการถ่ายยีนจากการแสดงออกของยีน gus แบบชั่วคราวโดยวิธี GUS histochemical assay พบว่า การใช้ A. tumefaciens สายพันธุ์ EHA105 เป็นพาหะโดยการใช้ความเข้มข้นของเชื้อ 10 x 108 เซลล์ต่อมิลลิลิตรถ่ายยีนเข้าสู่ชิ้นส่วนข้อที่สร้างบาดแผลโดยการ sonication นาน 5 วินาที โดยปลูกเชื้อนาน 5 ชั่วโมงและ co-cultivation นาน 3 วัน เป็นวิธีการถ่ายยีนในต้นสักที่มีประสิทธิภาพในการถ่ายยีนสูง จึงใช้ในการถ่ายยีน aroA เข้าสู่ต้นสัก
จากการตรวจสอบการคงอยู่ของยีนในต้นสักที่เจริญเติบโตบนอาหารคัดเลือกจำนวน 14 ต้น โดยเทคนิค PCR พบว่ามีเพียง 4 ต้นที่มีการคงอยู่ของยีนยีน gus และ aroA ครบทั้ง 2 ยีน
การถ่ายยีนเข้าสู่พืชมีหลายปัจจัยเข้ามาเกี่ยวข้อง การพัฒนาระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่เหมาะสมเป็นปัจจัยหนึ่งที่ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการถ่ายยีน โดยการศึกษานี้ได้ทำการศึกษาผลของชิ้นส่วนพืช สูตรอาหาร และสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เหมาะสมกับการชักนำแคลลัสในต้นสัก พบว่าการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนฐานใบต้นสักในอาหารสูตร MS ที่มีการเติมสารควบคุมการเจริญเติบโต NAA 0.1 มิลลิกรัมต่อลิตร ร่วมกับ BA 0.6 มิลลิกรัมต่อลิตร สามารถชักนำแคลลัสของต้นสักได้ดี แคลลัสที่ได้มีลักษณะเป็นแคลลัสแบบเกาะกันแน่น สีเหลืองอ่อน
ในการถ่ายยีนเข้าสู่พืชนิยมถ่ายยีนเครื่องหมายคัดเลือก เช่นยีนต้านทานสารปฏิชีวนะเข้าสู่พืชพร้อมกับยีนที่ต้องการ ซึ่งการใช้สารปฏิชีวนะในการคัดเลือกที่ไม่เหมาะสมจะมีผลต่อประสิทธิภาพการถ่ายยีนและการพัฒนาของเนื้อเยื่อ ดังนั้นในการศึกษานี้จึงทดสอบผลของสารปฏิชีวนะ hygromycin ความเข้มข้น 0, 3, 5, 10 และ 20 มิลลิกรัมต่อลิตร ที่มีต่อการเจริญของเนื้อเยื่อฐานใบ และข้อของต้นสักจำนวน 3 สายต้นคือ 26C33 22C53 และ16C7 ในสภาพปลอดเชื้อ เป็นระยะเวลา 5 สัปดาห์ พบว่าอาหารคัดเลือกที่เติม hygromycin ความเข้มข้น 5 มิลลิกรัมต่อลิตร เป็นระดับที่สามารถกำจัดชิ้นส่วนที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนได้ สำหรับการทดสอบสารปฏิชีวนะ cefotaxime ความเข้มข้น 0, 200, 250, 300, 350 และ 400 มิลลิกรัมต่อลิตร ต่อประสิทธิภาพในการกำจัดเชื้อส่วนเกิน และผลต่อการเกิดแคลลัสของเนื้อเยื่อต้นสัก พบว่าการใช้ cefotaxime ที่ความเข้มข้น 250-300 มิลลิกรัมต่อลิตรมีประสิทธิภาพสูงในการยับยั้งการเจริญเติบโตของ Agrobacterium tumefaciens และชิ้นส่วนต้นสักสามารถพัฒนาเกิดแคลลัสได้ ส่วนการคัดเลือกด้วยสารไกลโฟเสท พบว่าจาก การทดสอบสารความเข้มข้น 1-10 มิลลิโมลาร์ ความเข้มข้นที่ 1 มิลลิโมลาร์ดีที่สุด สามารถกำจัดชิ้นส่วนที่ไม่ได้รับการถ่ายยีนได้ทั้งหมด
เทคนิคการถ่ายยีนเข้าสู่เนื้อเยื่อพืชโดยใช้เครื่องยิงอนุภาคเป็นวิธีที่นิยมใช้อย่างแพร่หลายและมีประสิทธิภาพ เนื่องจากเป็นวิธีที่ง่ายและใช้ถ่ายยีนเข้าสู่จีโนมพืชได้หลายชนิด จากการศึกษาปัจจัยที่เกี่ยวกับการถ่ายยีนต้านทานต่อสารกำจัดวัชพืชไกลโฟเสท (aroA) ในชิ้นส่วนข้อ และฐานใบต้นสัก ได้แก่แรงดันก๊าซฮีเลียมที่ใช้ในการขับเคลื่อนอนุภาคเข้าสู่เนื้อเยื่อเป้าหมายที่ระดับ 900 1,100 และ 1,200 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว ระยะห่างระหว่างแท่นหยุดอนุภาคกับเนื้อเยื่อเป้าหมายที่ 6 9 และ 12 เซนติเมตร ตรวจสอบการแสดงออกของยีน gus แบบชั่วคราวโดยวิธี GUS histochemical assay พบว่าไม่มีชิ้นส่วนต้นสักที่ติดสีน้ำเงิน จึงต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อให้เกิดประสิทธิภาพในการถ่ายยีนต้านทานสารกำจัดวัชพืชไกลโฟเสทเข้าสู่ต้นสักด้วยเครื่องยิงอนุภาค
สำหรับการศึกษาปัจจัยที่มีผลต่อประสิทธิภาพการถ่ายยีนโดยใช้อโกรแบคทีเรียมเป็นพาหะได้ทำการทดสอบ 6 ปัจจัย คือ สายพันธุ์เชื้ออโกรแบคทีเรียม และความเข้มข้นของเชื้อ ชิ้นส่วนพืช การสร้างบาดแผล และระยะเวลาในการปลูกเชื้อและเลี้ยงร่วม จากการเปรียบเทียบประสิทธิภาพของการถ่ายยีนจากการแสดงออกของยีน gus แบบชั่วคราวโดยวิธี GUS histochemical assay พบว่า การใช้ A. tumefaciens สายพันธุ์ EHA105 เป็นพาหะโดยการใช้ความเข้มข้นของเชื้อ 10 x 108 เซลล์ต่อมิลลิลิตรถ่ายยีนเข้าสู่ชิ้นส่วนข้อที่สร้างบาดแผลโดยการ sonication นาน 5 วินาที โดยปลูกเชื้อนาน 5 ชั่วโมงและ co-cultivation นาน 3 วัน เป็นวิธีการถ่ายยีนในต้นสักที่มีประสิทธิภาพในการถ่ายยีนสูง จึงใช้ในการถ่ายยีน aroA เข้าสู่ต้นสัก
จากการตรวจสอบการคงอยู่ของยีนในต้นสักที่เจริญเติบโตบนอาหารคัดเลือกจำนวน 14 ต้น โดยเทคนิค PCR พบว่ามีเพียง 4 ต้นที่มีการคงอยู่ของยีนยีน gus และ aroA ครบทั้ง 2 ยีน |
| บทคัดย่อ (EN): |
There are several parameters involved in plan5t transformation. The optimization of parameters will help to elevate the efficiency of transformation. In this research, the effects of tissue type and plant growth regulators were studies in an attempt to induce callus formation in teak. It was founded that leaf base tissue cultured on MS media supplemented with 0.1 mg/l NAA and 0.6 mg/l BA was suitable for compact callus induction.
In general, plant transformation usually transfer the selectable marker genes such as antibioticor herbicide resistance genes together with the gene of interest into plant cells. Hence, the non-effective screening is one of the obstacles to the successful of the transformation event. As part of this research, hygromycin at the concentration of 0, 3, 5, 10 and 20 mg/l wasc tested to determine the in vitro effects on nodal and leaf base tissue. After 5 weeks in selective medium, the result revealed that hygromycin at the concentration of 5 mg/l could eliminate all of non-transform teak cells. For the testing with cefotaxim at the concentration of 0, 200, 250, 300, 350 and 400 mg/l to evaluate the effectiveness on Agrobacterium elimination and on callus growth. The results demonstrated that the concentration of 250-300 mg/l is effective for Agrobacterium elimination without any harmfull for callus growth. For glypsosate herbicide testing,of the concentration between 0-10 mM test, the concentration of 1 mM is suitable for the elimination of non-transformed teak cells.
For genetic transformation, particle bombardment is one of the techniques that widely used and effective for plant gene transformation. The technique is not so complicate and can be used in several plant species. This study was attempted to transform two types teak tissues, node and leaf base tissue, using gus reporter gene and aroA gene as selectable marker gene. The plasmid DNA coated particle was propelled by 900, 1,100 and 1,200 psi helium gas. The target tissue distances of 6, 9 and 12 cm were also tested. The transient expression of guy gene evaluated by GUS histochemical assay revealed no blue spot of gus gene expression which demonstrated the unsuccessful of the event. Thus, it is necessary to study more about other parameters and technique for the successful of genetic transformation in teak.
For Agrobacterium-mediated transformation, 6 parameters, bacterial strains, bacteria concentration, explants type, wounding type, inoculation and co-cultivation periods were tested. The transient expression as evaluated by GUS histochemical assay demonstrated the high percentage of transformation when using A. tumefaciens strain EHA105 at the concentration of 10 x 108 cells per ml to transform gene into nodal explants that wounding by sonication and inoculation for 5 hours then co-cultivation for 3 days. So that we used the optimal parameter to transform aroA gene into teak
All of putative transformed were subjected to PCR analysis of gus and aroA genes, the result revealed only 4 shoots in the presence of gus and aroA genes
There are several parameters involved in plan5t transformation. The optimization of parameters will help to elevate the efficiency of transformation. In this research, the effects of tissue type and plant growth regulators were studies in an attempt to induce callus formation in teak. It was founded that leaf base tissue cultured on MS media supplemented with 0.1 mg/l NAA and 0.6 mg/l BA was suitable for compact callus induction.
In general, plant transformation usually transfer the selectable marker genes such as antibioticor herbicide resistance genes together with the gene of interest into plant cells. Hence, the non-effective screening is one of the obstacles to the successful of the transformation event. As part of this research, hygromycin at the concentration of 0, 3, 5, 10 and 20 mg/l wasc tested to determine the in vitro effects on nodal and leaf base tissue. After 5 weeks in selective medium, the result revealed that hygromycin at the concentration of 5 mg/l could eliminate all of non-transform teak cells. For the testing with cefotaxim at the concentration of 0, 200, 250, 300, 350 and 400 mg/l to evaluate the effectiveness on Agrobacterium elimination and on callus growth. The results demonstrated that the concentration of 250-300 mg/l is effective for Agrobacterium elimination without any harmfull for callus growth. For glypsosate herbicide testing,of the concentration between 0-10 mM test, the concentration of 1 mM is suitable for the elimination of non-transformed teak cells.
For genetic transformation, particle bombardment is one of the techniques that widely used and effective for plant gene transformation. The technique is not so complicate and can be used in several plant species. This study was attempted to transform two types teak tissues, node and leaf base tissue, using gus reporter gene and aroA gene as selectable marker gene. The plasmid DNA coated particle was propelled by 900, 1,100 and 1,200 psi helium gas. The target tissue distances of 6, 9 and 12 cm were also tested. The transient expression of guy gene evaluated by GUS histochemical assay revealed no blue spot of gus gene expression which demonstrated the unsuccessful of the event. Thus, it is necessary to study more about other parameters and technique for the successful of genetic transformation in teak.
For Agrobacterium-mediated transformation, 6 parameters, bacterial strains, bacteria concentration, explants type, wounding type, inoculation and co-cultivation periods were tested. The transient expression as evaluated by GUS histochemical assay demonstrated the high percentage of transformation when using A. tumefaciens strain EHA105 at the concentration of 10 x 108 cells per ml to transform gene into nodal explants that wounding by sonication and inoculation for 5 hours then co-cultivation for 3 days. So that we used the optimal parameter to transform aroA gene into teak
All of putative transformed were subjected to PCR analysis of gus and aroA genes, the result revealed only 4 shoots in the presence of gus and aroA genes |
