| บทคัดย่อ: |
การดำเนินการวิจัย เรื่อง การจัดการโรคถั่วเหลืองโดยการใช้จุลินทรีย์เพื่อการผลิตพืชอย่างปลอดภัย โดยเริ่มจากการเฝ้าระวังติดตามการเกิดโรคระบาดของถั่วเหลืองตลอดระยะเวลา 3 ปี (งบประมาณปี 2550-2552) การศึกษาวิจัยพบว่าการแพร่กระจายของโรคสำคัญของถั่วเหลืองที่ระบาดในเขตภาคกลาง ช่วงตั้งแต่เริ่มปลูกจนกระทั่งเก็บเกี่ยวตามแหล่งผลิตเป็นการค้า ซึ่งทำการสำรวจใน 5 จังหวัดคือ กาญจนบุรี ลพบุรี สระบุรี อ่างทอง และนครราชสีมา พบชนิดโรคและการแพร่กระจายเฉลี่ยทุกจังหวัดจากมากไปน้อย ได้แก่ ราสนิม, แอนแทรคโนส, ไวรัสใบด่าง, เน่าคอดิน, ไวรัสใบยอดหด, ใบจุดนูน, โรคเน่าจาก Fusarium sp. และ Sclerotium sp., และโรคราน้ำค้าง นอกจากนั้นพบเชื้อราติดกับเมล็ดพันธุ์ AGS292 ซึ่งเป็นพันธุ์ที่ใช้ผลิตเป็นการค้า ได้แก่ โรคเมล็ดสีม่วง, เมล็ดเน่า, ใบและลำต้นไหม้, และแอนแทรคโนส จากการสำรวจและเฝ้าระวังการติดตามโรคครั้งนี้ยังพบว่า โรคใบจุดนูน แอนแทรคโนส และโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัส มีความสำคัญในอันดับต้น ๆ ต่อการผลิตถั่วเหลืองฝักสด โดยสถานการณ์การระบาดของโรคถั่วเหลืองที่เกิดขึ้นจะนำไปสู่การคาดการณ์การเกิดโรคในฤดูปลูกต่าง ๆ และพัฒนาเป็นโปรแกรมการพยากรณ์โรค ซึ่งจากข้อมูลการศึกษาวิจัยพบว่าโรคใบจุดนูนยังคงมีความสำคัญในระบบการผลิต จึงศึกษาปริมาณเชื้อสาเหตุที่มีผลต่อระดับความรุนแรงของโรคโดยที่ความเข้มข้นเชื้อ 1x106, 1x108 และ 1x109cfu/ml ที่อุณหภูมิ ?33 0C และมีความชื้นสัมพัทธ์ ?80% จะก่อให้เกิดโรครุนแรง 15.1, 21.2 และ 28.4 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ
การศึกษาข้อมูลเชิงลึกในระดับสรีรวิทยาและชีวโมเลกุลของเชื้อ Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag) สาเหตุโรคใบจุดนูนถั่วเหลือง โดยทำการตรวจสอบยีนที่แสดงความจำเพาะเจาะจงในการก่อให้เกิดโรคของเชื้อ Xag บนถั่วเหลืองทั้งสายพันธุ์อ่อนแอ (สจ.4, Spencer และ PI 520733) และพันธุ์ต้านทาน (Williams 82) สามารถแบ่งกลุ่ม Xag ออกเป็น 3 กลุ่ม (race) คือ กลุ่มที่ 1 Xag สามารถชักนำให้เกิดปฏิกิริยาเซลล์ตายอย่างเฉียบพลัน (HR) บนถั่วเหลืองทั้ง 3 พันธุ์ทดสอบ ภายใน 48 ชั่วโมง กลุ่มที่ 2 Xag สามารถก่อให้เกิดโรคบนถั่วเหลืองทดสอบทั้ง 3 พันธุ์ กลุ่มที่ 3 Xag สามารถชักนำให้เกิดปฏิกิริยา HR บนถั่วเหลืองพันธุ์ต้านทาน แต่ก่อให้เกิดโรคบนพันธุ์อ่อนแอ และพบว่า avr genes เป็นยีนควบคุมการแสดงออกลักษณะดังกล่าว โดยยีนนี้เป็นสมาชิกในกลุ่ม avrBs3 ซึ่งมีความจำเพาะเจาะจงต่อเชื้อ Xag เฉพาะกลุ่มที่ 3 การศึกษาครั้งนี้จึงได้ตั้งชื่อใหม่ คือ avrXg1 โดย Xag สูญเสียความจำเพาะเจาะจงในการก่อให้เกิดโรคเมื่อกลายพันธุ์ avrXg1 ด้วยวิธี Tn5 pointed insertion mutagenesis นอกจากนี้ได้ศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิตสาร diffusible signal facter (DSF) ใน Xag พบว่า Xag สามารถสร้างสาร DSF เพื่อส่งเสริมความรุนแรงในการก่อให้เกิดโรค ซึ่งการผลิตสาร DSF นี้ควบคุมโดย rpfF ยีน และพบว่ายีนดังกล่าวเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ปัจจัยที่สำคัญในการก่อให้เกิดโรคหลายชนิด เช่น exoenzymes (cellulase, protease, endo-B-mannanase, pectate lyase, polygalactulonate lyase และ endoglucanase) รวมทั้งความสามารถในการผลิต siderophore ซึ่งล้วนแล้วแต่จะมีผลต่อการก่อให้เกิดความรุนแรงและการเกิดโรคกับถั่วเหลืองซึ่งผลการวิจัยเหล่านี้นำไปสู่การพัฒนาการควบคุมโรคได้สมบูรณ์ขึ้น
จากงานวิจัยข้างต้นจึงได้พัฒนาวิธีการจัดการโรคของถั่วเหลืองและถั่วเหลืองฝักสดอย่างเหมาะสมปลอดภัยด้วยการนำเชื้อสาเหตุโรคสายพันธุ์กลายจาก pathogenicity genes ข้างต้น (rpfF และ avr genes) ศึกษาวิจัยเปรียบเทียบกับจุลินทรีย์ที่มีประโยชน์จากธรรมชาติเข้าร่วมในระบบการผลิตถั่วเหลืองฝักสด โดยเริ่มตั้งแต่การศึกษาคัดเลือกเชื้อปฏิปักษ์บริเวณรอบรากถั่วเหลือง และทำการศึกษาถึงกลไกหลักและวิธีการประยุกต์ใช้ในสภาพแปลงทดลอง พบว่าแบคทีเรียปฏิปักษ์ 2 สายพันธุ์ ได้แก่ Bacillus amyloliquefaciens KPS46 และ Paenibacillus pabuli SW01/4 ตลอดจนเชื้อ rpfF และ avr mutant 2 สายพันธุ์แสดงประสิทธิภาพในการกระตุ้นภูมิต้านทานถั่วเหลืองและสามารถควบคุมโรครากและโคนเน่า โรคใบจุดนูน ตลอดจนส่งเสริมการเจริญเติบโตของถั่วเหลืองได้อย่างดี (KPS46 และ SW01/4=PGPR) โดยกลไกการทำงานของแบคทีเรียปฏิปักษ์ KPS46 ซึ่งสามารถควบคุมโรคได้?หลายชนิดทั้งโรคที่ระบบรากและโรคที่ใบ เมื่อนำมาคลุกเมล็ดก่อนปลูกสามารถลดความรุนแรงของโรคใบจุดนูนถั่วเหลืองได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุมโดยให้ผลสอดคล้องกันกับปริมาณการสะสมเอนไซม์ ?-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase, salicylic acid และสารประกอบ phenolic ซึ่งเป็ การดำเนินการวิจัย เรื่อง การจัดการโรคถั่วเหลืองโดยการใช้จุลินทรีย์เพื่อการผลิตพืชอย่างปลอดภัย โดยเริ่มจากการเฝ้าระวังติดตามการเกิดโรคระบาดของถั่วเหลืองตลอดระยะเวลา 3 ปี (งบประมาณปี 2550-2552) การศึกษาวิจัยพบว่าการแพร่กระจายของโรคสำคัญของถั่วเหลืองที่ระบาดในเขตภาคกลาง ช่วงตั้งแต่เริ่มปลูกจนกระทั่งเก็บเกี่ยวตามแหล่งผลิตเป็นการค้า ซึ่งทำการสำรวจใน 5 จังหวัดคือ กาญจนบุรี ลพบุรี สระบุรี อ่างทอง และนครราชสีมา พบชนิดโรคและการแพร่กระจายเฉลี่ยทุกจังหวัดจากมากไปน้อย ได้แก่ ราสนิม, แอนแทรคโนส, ไวรัสใบด่าง, เน่าคอดิน, ไวรัสใบยอดหด, ใบจุดนูน, โรคเน่าจาก Fusarium sp. และ Sclerotium sp., และโรคราน้ำค้าง นอกจากนั้นพบเชื้อราติดกับเมล็ดพันธุ์ AGS292 ซึ่งเป็นพันธุ์ที่ใช้ผลิตเป็นการค้า ได้แก่ โรคเมล็ดสีม่วง, เมล็ดเน่า, ใบและลำต้นไหม้, และแอนแทรคโนส จากการสำรวจและเฝ้าระวังการติดตามโรคครั้งนี้ยังพบว่า โรคใบจุดนูน แอนแทรคโนส และโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัส มีความสำคัญในอันดับต้น ๆ ต่อการผลิตถั่วเหลืองฝักสด โดยสถานการณ์การระบาดของโรคถั่วเหลืองที่เกิดขึ้นจะนำไปสู่การคาดการณ์การเกิดโรคในฤดูปลูกต่าง ๆ และพัฒนาเป็นโปรแกรมการพยากรณ์โรค ซึ่งจากข้อมูลการศึกษาวิจัยพบว่าโรคใบจุดนูนยังคงมีความสำคัญในระบบการผลิต จึงศึกษาปริมาณเชื้อสาเหตุที่มีผลต่อระดับความรุนแรงของโรคโดยที่ความเข้มข้นเชื้อ 1x106, 1x108 และ 1x109cfu/ml ที่อุณหภูมิ ?33 0C และมีความชื้นสัมพัทธ์ ?80% จะก่อให้เกิดโรครุนแรง 15.1, 21.2 และ 28.4 เปอร์เซ็นต์ ตามลำดับ
การศึกษาข้อมูลเชิงลึกในระดับสรีรวิทยาและชีวโมเลกุลของเชื้อ Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag) สาเหตุโรคใบจุดนูนถั่วเหลือง โดยทำการตรวจสอบยีนที่แสดงความจำเพาะเจาะจงในการก่อให้เกิดโรคของเชื้อ Xag บนถั่วเหลืองทั้งสายพันธุ์อ่อนแอ (สจ.4, Spencer และ PI 520733) และพันธุ์ต้านทาน (Williams 82) สามารถแบ่งกลุ่ม Xag ออกเป็น 3 กลุ่ม (race) คือ กลุ่มที่ 1 Xag สามารถชักนำให้เกิดปฏิกิริยาเซลล์ตายอย่างเฉียบพลัน (HR) บนถั่วเหลืองทั้ง 3 พันธุ์ทดสอบ ภายใน 48 ชั่วโมง กลุ่มที่ 2 Xag สามารถก่อให้เกิดโรคบนถั่วเหลืองทดสอบทั้ง 3 พันธุ์ กลุ่มที่ 3 Xag สามารถชักนำให้เกิดปฏิกิริยา HR บนถั่วเหลืองพันธุ์ต้านทาน แต่ก่อให้เกิดโรคบนพันธุ์อ่อนแอ และพบว่า avr genes เป็นยีนควบคุมการแสดงออกลักษณะดังกล่าว โดยยีนนี้เป็นสมาชิกในกลุ่ม avrBs3 ซึ่งมีความจำเพาะเจาะจงต่อเชื้อ Xag เฉพาะกลุ่มที่ 3 การศึกษาครั้งนี้จึงได้ตั้งชื่อใหม่ คือ avrXg1 โดย Xag สูญเสียความจำเพาะเจาะจงในการก่อให้เกิดโรคเมื่อกลายพันธุ์ avrXg1 ด้วยวิธี Tn5 pointed insertion mutagenesis นอกจากนี้ได้ศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิตสาร diffusible signal facter (DSF) ใน Xag พบว่า Xag สามารถสร้างสาร DSF เพื่อส่งเสริมความรุนแรงในการก่อให้เกิดโรค ซึ่งการผลิตสาร DSF นี้ควบคุมโดย rpfF ยีน และพบว่ายีนดังกล่าวเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ปัจจัยที่สำคัญในการก่อให้เกิดโรคหลายชนิด เช่น exoenzymes (cellulase, protease, endo-B-mannanase, pectate lyase, polygalactulonate lyase และ endoglucanase) รวมทั้งความสามารถในการผลิต siderophore ซึ่งล้วนแล้วแต่จะมีผลต่อการก่อให้เกิดความรุนแรงและการเกิดโรคกับถั่วเหลืองซึ่งผลการวิจัยเหล่านี้นำไปสู่การพัฒนาการควบคุมโรคได้สมบูรณ์ขึ้น
จากงานวิจัยข้างต้นจึงได้พัฒนาวิธีการจัดการโรคของถั่วเหลืองและถั่วเหลืองฝักสดอย่างเหมาะสมปลอดภัยด้วยการนำเชื้อสาเหตุโรคสายพันธุ์กลายจาก pathogenicity genes ข้างต้น (rpfF และ avr genes) ศึกษาวิจัยเปรียบเทียบกับจุลินทรีย์ที่มีประโยชน์จากธรรมชาติเข้าร่วมในระบบการผลิตถั่วเหลืองฝักสด โดยเริ่มตั้งแต่การศึกษาคัดเลือกเชื้อปฏิปักษ์บริเวณรอบรากถั่วเหลือง และทำการศึกษาถึงกลไกหลักและวิธีการประยุกต์ใช้ในสภาพแปลงทดลอง พบว่าแบคทีเรียปฏิปักษ์ 2 สายพันธุ์ ได้แก่ Bacillus amyloliquefaciens KPS46 และ Paenibacillus pabuli SW01/4 ตลอดจนเชื้อ rpfF และ avr mutant 2 สายพันธุ์แสดงประสิทธิภาพในการกระตุ้นภูมิต้านทานถั่วเหลืองและสามารถควบคุมโรครากและโคนเน่า โรคใบจุดนูน ตลอดจนส่งเสริมการเจริญเติบโตของถั่วเหลืองได้อย่างดี (KPS46 และ SW01/4=PGPR) โดยกลไกการทำงานของแบคทีเรียปฏิปักษ์ KPS46 ซึ่งสามารถควบคุมโรคได้?หลายชนิดทั้งโรคที่ระบบรากและโรคที่ใบ เมื่อนำมาคลุกเมล็ดก่อนปลูกสามารถลดความรุนแรงของโรคใบจุดนูนถั่วเหลืองได้อย่างมีประสิทธิภาพเมื่อเปรียบเทียบกับกรรมวิธีควบคุมโดยให้ผลสอดคล้องกันกับปริมาณการสะสมเอนไซม์ ?-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase, salicylic acid และสารประกอบ phenolic ซึ่งเป็ |
| บทคัดย่อ (EN): |
Disease monitor and survey in three-year program from 2006 to 2009 revealed that the importance of diseases differed in central area of 5 provinces from one soybean growing region to another including Kanchanaburi, Lopburi, Saraburi, and NakhonRachasima. The average of disease epidemic from high to low severity was rust, anthracnose, soybean mosaic virus, damping off, soybean crinkle leaf virus, bacterial pustule, stem rot caused by Fusarium sp. and Sclerotium sp., and downy mildew respectively. The study also found that disease infestation of commercial seeds cv. AGS292 was great damage with purple seed stain, seed lot, leaf and stem blight, and anthracnose. An intensive survey of both soybean and green soybean within central area indicated that the major diseases were bacterial pustule, anthracnose, soybean mosaic virus and soybean crinkle leaf virus. The study has then, been focused on physiological and molecular levels of soybean bacterial pustule caused by Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag) for more effective management strategies. Experiment evidence on the capacity of pathogen population to quantitatively adapt to its host was conducted. A close association was found between Xag density and the disease or severity it caused together with favored conditions. At 1x106, 1x108, and 1x109cfu/ml of Xag; and ?33 0C with ?80 %RH, the severity of bacterial pustule of 15.1, 21.2, and 28.4 % was observed. These data developed for either monitoring or forecasting are essential for effective management program.
The related investigation for better knowledge of quantitative soybean and Xag interactions supported by the gene-for-gene hypothesis were identified on aggressiveness component occurred in Xag field population using its avr genes characterization. Three races of Xag were identified that race 1 induced HR within 48 h on resistance (Willium82) and susceptibility (SJ4, Spencer, and PI520733) soybean cultivars. Race 2 induced disease on all cultivars tested, and race 3 elicited HR on specific pustule-resistant cultivar (Willium82). Avirulent genes studied, an avrBs3 homolog that avrXg1 new-named by this study was identified and carried on plasmid DNA of Xag strains in race 3 only. Mutation of avrXg1 by Tn5 pointed insertion resulted in enhanced virulence and bacterial population on resistant and susceptible cultivars. Other pathogenicity genes of Xag were also studied for more regulation roles that the rpfF, a gene encoding for the biosynthesis of an extracellular diffusible factor (DSF) was characterized. The rpfF produced DSF related to a well-characterized quorum sensing molecules, and various virulent factors including exoenzymes (cellulase, protease, endo-B-mannanase, pectate lyase, polygalactulonate lyase and endoglucanase). These factors are essential for full virulence of Xag on soybean.
The two mutants mentioned above as the weakly virulent strains, avrXg1 and rpfF-deficit strains; and the bacterial antagonists screened in this study from soybean rhizosphere including Bacillus amyloliquefaciens KPS46 and Paenibacillus pabuli SW01/4 were used for biological control with their various mechanisms. They effectively suppressed seed and root rot, and foliar diseases (e.g. bacterial pustule) when they were treated to seed as bacterization according to accurated antibiosis mechanism and systemic acquired resistance by induced defense-related enzymes accumulation in plant (?-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase, salicylic acid, and phenolic compound). These enzymes are toxic to pathogens and inhibited their colonization.
One bacterial antagonist strain KPS46 that showed the best results in suppressing diseases was further developed in formulated products for effective shelf life and commercial use. Protocols of KPS46 mass production in liquid fermentation of soybean meal and molasses or fish meal and molasses that cross linked matrix with several inexpensive organic carriers including Disease monitor and survey in three-year program from 2006 to 2009 revealed that the importance of diseases differed in central area of 5 provinces from one soybean growing region to another including Kanchanaburi, Lopburi, Saraburi, and NakhonRachasima. The average of disease epidemic from high to low severity was rust, anthracnose, soybean mosaic virus, damping off, soybean crinkle leaf virus, bacterial pustule, stem rot caused by Fusarium sp. and Sclerotium sp., and downy mildew respectively. The study also found that disease infestation of commercial seeds cv. AGS292 was great damage with purple seed stain, seed lot, leaf and stem blight, and anthracnose. An intensive survey of both soybean and green soybean within central area indicated that the major diseases were bacterial pustule, anthracnose, soybean mosaic virus and soybean crinkle leaf virus. The study has then, been focused on physiological and molecular levels of soybean bacterial pustule caused by Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag) for more effective management strategies. Experiment evidence on the capacity of pathogen population to quantitatively adapt to its host was conducted. A close association was found between Xag density and the disease or severity it caused together with favored conditions. At 1x106, 1x108, and 1x109cfu/ml of Xag; and ?33 0C with ?80 %RH, the severity of bacterial pustule of 15.1, 21.2, and 28.4 % was observed. These data developed for either monitoring or forecasting are essential for effective management program.
The related investigation for better knowledge of quantitative soybean and Xag interactions supported by the gene-for-gene hypothesis were identified on aggressiveness component occurred in Xag field population using its avr genes characterization. Three races of Xag were identified that race 1 induced HR within 48 h on resistance (Willium82) and susceptibility (SJ4, Spencer, and PI520733) soybean cultivars. Race 2 induced disease on all cultivars tested, and race 3 elicited HR on specific pustule-resistant cultivar (Willium82). Avirulent genes studied, an avrBs3 homolog that avrXg1 new-named by this study was identified and carried on plasmid DNA of Xag strains in race 3 only. Mutation of avrXg1 by Tn5 pointed insertion resulted in enhanced virulence and bacterial population on resistant and susceptible cultivars. Other pathogenicity genes of Xag were also studied for more regulation roles that the rpfF, a gene encoding for the biosynthesis of an extracellular diffusible factor (DSF) was characterized. The rpfF produced DSF related to a well-characterized quorum sensing molecules, and various virulent factors including exoenzymes (cellulase, protease, endo-B-mannanase, pectate lyase, polygalactulonate lyase and endoglucanase). These factors are essential for full virulence of Xag on soybean.
The two mutants mentioned above as the weakly virulent strains, avrXg1 and rpfF-deficit strains; and the bacterial antagonists screened in this study from soybean rhizosphere including Bacillus amyloliquefaciens KPS46 and Paenibacillus pabuli SW01/4 were used for biological control with their various mechanisms. They effectively suppressed seed and root rot, and foliar diseases (e.g. bacterial pustule) when they were treated to seed as bacterization according to accurated antibiosis mechanism and systemic acquired resistance by induced defense-related enzymes accumulation in plant (?-1,3-glucanase, phenylalanine ammonia-lyase, peroxidase, salicylic acid, and phenolic compound). These enzymes are toxic to pathogens and inhibited their colonization.
One bacterial antagonist strain KPS46 that showed the best results in suppressing diseases was further developed in formulated products for effective shelf life and commercial use. Protocols of KPS46 mass production in liquid fermentation of soybean meal and molasses or fish meal and molasses that cross linked matrix with several inexpensive organic carriers including |
