| บทคัดย่อ: |
ชุดโครงการนี้ประกอบไปด้วย 4 โครงการวิจัยย่อยได้แก่ โครงการการวิเคราะห์สารประกอบ ทางเคมีและคุณสมบัติการยับยั้งเอนไซม์อะเซทิสโคลินเอสเทอเรสของพืชสกุลเปราะ โครงการฤทธิ์ต้าน แบคที่เรียก่อโรคปริทันต์ของสารสกัดพืชสกุลเปรา ะ โครงการการขยายพันธุ์เปราะบางชนิดในสภาพ ปลอดเชื้อและในสภาพโรงเรือน และโครงการการจัดจำแนกพืชสกุลเปราะโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ บาร์โค้ด สำหรับผลการศึกษาองค์ประกอบทางเคมีของเหจ้าเปราะ 2 ชนิด คือ กระชายดำ (Koempferia parvifiora) และกำบังภัย (Kaempferia elegans) พบว่าสามารถแยกสารกลุ่ม methoxyflavones ได้ 8 ชนิดจากส่วนสกัดหยาบไดคลอโรมีเทนและเมทานอลของกระชายดำ สาร เหล่านี้ใด้แก่ 5-hydroxy-3.7-dimethoxyiavone (1). 5-hydroxy-7-methoxyfilavone (2). 5- hydroxy-3.7.4-trimethoxyflavone (3). 5-hydroxy-7.4-dimethoxyilavone (4) 5-hydroxy- 3,7.3.4-tetramethoxyflavone (5) 3,5,7-trimethoxyfiavone (6), 3,5.7.3,4-pentamethoxyflavone (7) และ 5.7.4-trimethoxy lavone (8) ในขณะที่สารที่แยกได้จากส่วนสกัดหยาบเอทานอลจากกำบัง ภัย ได้แก่ fovokawain B (9) แล ะ 5.6-dehydrokowain (10) ในการศึกษาฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์อะเซทิล โคลืนเอสเทอเรสของสารที่แยกได้ด้วยวิธี TLC bioautogrophy พบว่ามีเพียง 5.7.4-trimethoxyilavone (8) ที่แสดงฤทธิ์ยับยั้งเอนไซม์อะเซทิลโคลีนเอสเทอเรสที่ความเข้มข้นต่ำสุด (MR) คือ 10 ng ในขณะที่ สารอื่นไม่มีฤทธิ์ยับยั้งที่ความเข้มชัน 1000 ng เมื่อเทียบกับสารมาตรฐาน (galantcmine, MIR = 1 ng) ในการศึกษาฤทธิ์ด้านแบคที่เรียก่อโรคปริทันต์ของสารสกัดพืชสกุลเปราะ พบว่น้ำมันหอม ระเหยจากเหจ้าของกระชายดำมีฤทธิ์ยับยั้งเชื้อแบคที่เรียได้ดีที่สุด โดยบริเวณที่ยับยั้งมีค่เฉลี่ยเท่ากับ 22.08+0.63. 19.870.45 19.910.67 และ 21.06-1.03 มิสลิเมตร เมื่อทดสอบกับเชื้อ Porphyromonas gingivalis. Prevotella intermedia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans และ Tannerelia forsythia ตามลำดับ ขณะที่สารสกัดเอทานอลของเหง้ากระชายดำแสดงค่าเฉลี่ยเท่ากับ 16.74L0.17. 15.01:0.64. 16.72x0.72 และ 16.19:0.55 มิลลิเมตร เมื่อทดสอบด้วยวิธี agar dlffusion ตามลำดับ ผลการศึกษาเวลาที่สามารถฆ่าเชื้อได้ของสารละลายน้ำมันหอมระเหยเท่ากับ 80+34.64. 60+0.00, 100+34.64 และ 6040.00 นาที เมื่อทดสอบกับเชื้อ Porphyromonas gingivalis. Prevotella intermedlio, Aggregatibacter actinomycetemcomitans และ T. forsythia ตามลำดับ และน้ำมันหอม ระเหยจากเหากระชายดำมีค่าความเข้มขันต่ำที่สุดที่สามารถยับยั้งเชื้อได้เมื่อทดสอบกับเชื้อ Porphyromonas gingivalls เท่ากับ 15 ไมโครกรัมต่อมิลลิสิตร สำหวับการศึกษากาวขยายพันธุ์เปราะบางชนิด พบว่าสภา พอาหารเหลวสูตว MS คัดแปลง ส่งผลให้ว่านหาวนอนเกิดยอดได้มากกว่าสภาพอาหารวุ้น โดยเกิดยอด 5.63 ยอด เมื่อเทียบกับ 4.05 ยอด และพบว่าการเติม BAP หรือ TDZ ในระดับความเข้มชัน 0.5 หรือ 1.0 มก/ล ในอาหารส่งเสริมการ เกิดยอดได้ 4.70-6.15 ยอด ซึ่งมากกว่าการเลี้ยงในอาหารที่ไม่เพิ่มสารควบคุมการเจริญเติบโตที่เกิด ยอดเพียง 2.80 ยอด และพบว่าถ่านกัมมันต์ทำให้การเกิดยอดลดลงแต่ทำให้ตันมีความสูงเพิ่มขึ้น นอกจากนี้ยังทำให้ความกว้างใบลดลงแต่ไม่ส่งผลต่อจำนวนใบ จำนวนรากและความยาวราก ในขณะที่ น้ำตาลซูโครสความเข้มข้นแกต่างกันไม่ส่งผลต่อจำนวนยอด โดยเกิดยอด 1.10-1.45 ยอด แต่น้ำตาล ซูโครสความเข้มข้น 8% ทำให้ความสูง จำนวนใบแล ละขนาดใบทั้งความกว้างและความยาวใบลดลง และน้ำตาลซูโครสค วามเข้มข้น 8% นี้ ยังทำให้จำนวนรากเพิ่มมากขึ้นทั้งยังทำให้ความยาวรากลดลง อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้พบว่าถ่านกัมมันต์ทำให้จำนวนยอดของเปราะสายพันธุ์ K-LP03 ลดลง เช่นเดียวกัน แต่น้ำตาลซูโครสเพียงปัจจัยเดียวไม่ส่งผลต่อจำนวนยอด โดยเกิดยอด 1.50-1.95 ยอด ถ่านกัมมันต์ยังทำให้จำนวนใบของเปราะสายพันธุ์นี้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ พบว่ทั้งสองปัจจัยเดี่ยวไม่ ส่งผลต่อความสูง ขนาดใบ และไม่ส่งผลต่อจำนวนรากและความยาวราก ส่วนการเลี้ยงเปราะสาย พันธุ์ K-LP03 ภายใต้สภาพแสงแกต่างกันในอาหารที่เติมและไม่เติมถ่นกัมมันต์พบว่ถ่านกัมมันต์ทำ ให้จำนวนยอ ดลดลงแต่ไม่ส่งผลต่อความสูง โดยแสงสีเขียวทำให้เกิดยอดได้มากถึง 3.60 ยอด ซึ่ง มากกว่าการเลี้ยงภายใต้แสงสีชาวที่ได้จากทั้งจากหลอดเกลียว หรือหลอด LED ที่เกิดยอด 1.85-245 ยอด แต่จำนวนยอดนี้ไม่แตกต่างทางสถิติจากจำนวนยอดที่ได้เมื่อเลี้ยงภายใต้แสงสีแดงและสีเหลือง ซึ่งทำให้เกิดยอดจำนวน 2.85 และ 3.20 ยอดตามลำดับ อย่างไรก็ตามสภาพแสงสีแตกต่างกันส่งผล ต่อความสูง จำนวนใบ รวมทั้งจำนวนรากและความยาวราก และทำให้ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางโคนต้น แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ โดยพบว่า แสงสีขาวไม่ว่าจากหลอดเกลียวหรือหลอด LED ทำ ให้โคนต้นมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.52-0.55 ชม ซึ่งแตกต่างทางสถิติจากสภาพแสงสีฟ้าที่โคนต้นมีเส้น ผ่านศูนย์กลาง 0.48 ชม ส่วนแสงสีเขียว แดง เหลือง ทำให้โคนต้นมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 0.26-0.35 ซม ทั้งนี้ถ่านกัมมันต์ไม่ส่งผลต่อขนาดโคนต้น สำหรับการย้ายต้นอ่อนเปราะบางชนิดออกปลูกในสภาพ โรงเรือนโดยทดลองวัสดุปลูก พบว่าในระยะเวลา 15 สัปดาห์ ต้นอ่อนสามารถเจริญเติบโตได้แตกต่าง กัน โดยว่านหาวนอนมีความสูงต้นมากถึง 3.55 ซม เมื่อเลี้ยงในวัสดุปลูกที่ประกอบด้วยแกลบดำและ กาบมะพร้าว อัตราส่วน 1:1 โดยแตกต่างจากต้นที่เลี้ยงในวัสดุปลูกที่มีตินดำเพียงอย่างเดียว ที่ตันมี ความสูงเพียง 1.95 ซม โดยในสัปดาห์ที่ 20 พบว่าการใช้แกลบดำผสมกับขุยมะพร้าวหรือกาบมะพร้าว อัตราส่วน 1:1 ทำให้ส่วนหัวมีการเจริญดีทั้งด้าน น้ำหนักสด ขนาดหัว และขนาดรากสะสมอาหาร ในขณะที่การใช้แกลบขาวอย่างเดียวเป็นวัสดุปลูกนั้น ไม่พบการลงหัวของว่านหาวนอนเลย ส่วน เปราะสายพันธุ์ K-LP02 ที่เลี้ยงในดินดำและขุยมะพร้าวอัตราส่วน 1:1 นั้น มีความกว้างใบถึง 5.05 ซม แต่การใช้แกลบขาวเพียงอย่างเดียวทำให้ใบมีความยาวถึง 10.36 ชม พบว่วัสดุปลูกที่มีดินดำและ ขุยมะพร้าว อัตราส่วน 1:1 ทำให้มีน้ำหนักหัวรวมถึง 18.31 กรัม ซึ่งแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ จากทุกกรรมริธี สำหรับเปราะสายพันธุ์ K-LP03 เจริญด้ดีแตกต่างกันในแต่ละกรรมวิธี โดยเจริญ ด้านความสูงและจำนวนใบได้น้อยในวัสดุปลูกที่มีตินดำเป็นองค์ประกอบเพียงอย่างเดียว เช่นเดียวกับ เปราะสายพันธุ์อื่นๆ อย่างไรก็ตามพบว่าส่วนเจริญใต้ดินในวัสดุปลูกที่มีส่วนประกอบของตินดำ เปลือก ถั่ว และขุยมะพร้าว อัตราส่วน 1:1:1 นั้นมีน้ำหนักสูงสุดถึง 23.48 กรัม นอกจากนี้พบว่การใช้สาร ชีวภัณฑ์บางชนิดและบางระดับเท่านั้นที่ทำให้การเจริญเติบโตด้านความสูงตัน จำนวนใบ และขนาดใบ ของว่านหาวนอนมีแนวโน้มที่ดีแต่ไม่แตกต่างจากก การใช้น้ำปกติ ยิ่งไปกว่านั้นสารชีวภัณฑ์ที่ใช้ในการ ทดลองไม่ทำให้การเจริญส่วนเหนือดินและใต้ดินของเปราะสายพันธ์ K-LP03 แตกต่างจากการใช้น้ำ ปกติ ในการศึกษาการจัดจำแนกพืชสกุลเปราะโดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอบาร์โค้ด มีวัตถุประสงค์ ในการระบุชนิดพืชสกุลเปราะทั้งหมด 37 ตัวอย่าง จำนวน 12 ชนิด ได้แก่ ได้แก่ K dlbomoculata, K. angustifolio. K. elegan. K. galanga. K. grandlifolia, K. marginato, K. minuta. K. palchro. K. pardi. K. parviflora, K. roscoeana และ K. rotunda สำหรับตำแหน่งของตีเอ็นเอมาตรฐานในคลอโรพลาสต์ที่ เลือกศึกษาจำนวน 6 ตำแหน่ง ได้แก่ ส่วนของยืน 4 ยืน คือ mtK. rpcB, rpoC1 และ rbd. และ 2 intergenic spocer ได้แก่ psbA-tH กับ tL วิเคราะห์ข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธี Neighbor- Joining และใช้แบบจำลองวิวัฒนาการของ Kimura 2-parometer โดยโปรแกรม MEGA รุ่น 6 ผล การศึกษาตีเอ็นเอบาร์โค้ด 6 ตำแหน่ง พบว่ระบุชนิดพืชสกุลเปราะที่ศึกษาได้ 10 ชนิดจากทั้งหมด 12 ชนิด โดยต้องใช้ข้อมูลลำตับนิวคลีโอไทด์ 3 ตำแหน่งร่วมกัน ได้แก่ maK. rOB และ pSbA-tnH |
| บทคัดย่อ (EN): |
This research program consists of four research projects. These research projects are phytochemical compounds and acetylcholinesterase inhibition of Kaempferio, antibacterial activity of Koempferia extracts against periodontogenic bacteria, in vitro and in vivo propagation of some Kaempferia and identification of genus Kaempferia using DNA barcode. The results of phytochemical investigation of the rhizome extracts of two Kaempferio species, Kaempferia parviflora and Kaempferia elegans showed that 8 methoxyflavones were isolated from the dichloromethane and methanol extracts of K. parviflora. These compounds were 5-hydroxy-3,7- dimethoxyflavone (1), 5-hydroxy-7-methoxyflavone (2). 5-hydroxy-3,7.4-trimethoxyflavone (3). 5-hydroxy-7,4-dimethoxyflavone(4) 5-hydroxy-3,7.3,4-tetramethoxyflavone (5), 3.5.7- trimethoxyflavone (6), 3.5.7.3.4-pentamethoxyflavone (7) and 5.7.4-trimethoxyflavone (8). While, the isolated compounds from the ethanolic extract of K. elegans were flavokawain B (9) and 5.6-dehydrokawain (10). The acetyicholinesterase inhibitory activity of these isolated compounds was evaluated by TLC bioautographic technique. The results showed that only 5,7,4-trimethoxyflavone (8) was able to inhibit the acetylcholinesterase activity with a minimum inhibit requirement (MIR) of 10 ng. Whereas, the others were inactive at MIR of 1000 ng compared with the standard compound (galanthamine. MIR = 1 ng). The study of antibacterial activity against periodontogenic bacteria of Kaempferia extracts indicated that volatile oil from bullb of Krachaidum (K. parvifiora) exhibited the strongest antibacterial activities with the clear zone inhibition of 22.08-0.63 mm, 19.870.45 mm, 19.910.67 mm and 21.06-1.03 mm against Porphyromonas gingivalis. Prevotella intermedio. Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Tannerella forsythia, respectively. While, ethanolic extract from bullb of Krachaidum (K. parviflora) exhibited the activities which of 16.74-0.17 mm, 15.01+0.64 mm, 16.72t0.72 mm and 16.19-0.55 mm after tested by agar diffusion, respectively. The killing time of volatile oil from bulb of Proahom (K. galanga) were 80+34.64, 60+0.00, 100+34.64 and 60+0.00 min after tested with agar dilution, respectively. MIC which inhibited the growth of P. gingivalis was 15 ug/ml. For in vitro propagation studies of some Koempferia. the result showed that liquid MS media promoted shoot multiplication in K. rotunda better than MS agar media. There were 5.63 shootlets in liquid media while only 4.05 shootlets produced in agar media. Adding 0.5 or 1.0 mg/L of BAP or TDZ induced 4.70-6.15 shootlets which were significantly more than 2.80 shootlets produced in basic MS media. Activated charcoal (AC) decreased shootlet number but increase height of plantlets. Moreover, it decreased leaf width but had no effect on number of leaves. number of roots and their length. Various concentrations of sucrose had no significant effects on number of shoots. 1.10-1.45 shootlets were produced. However. 8% sucrose could decrease height, number of leaves, and size of leaves but could increase number of roots having significant shorter length. AC also decreased number of shoots of Kaempferia code K-LPO3. Sole sucrose did not affect number of shoots which 1.50-1.95 shootlets were obtained. AC significantly decreased number of leaves. Co-presence of AC and sucrose did not affected height, size of leaves, number and length of roots. Kaempferia code K-LP03 were also cultured onto media with or without AC under different light conditions. It was found that AC decreased number of shoots but not height. Green light induced up to 3.0 shootlets which were more than those. 1.85-2.45 shootlets, produced under white light either from spiral light bulb or LED. However the number was not significantly different from those produced under red and yellow light. 2.85 and 3.20 shootlets, respectively. Light conditions, in addition, had effects on height. number of leaves, number of roots, and root length. White light either from spiral light bulb or LED promoted diameter of pseudo-stem, 0.52-0.55 cm, which significantly differed from 0.48 cm, obtained under blue light; 0.26-0.35 cm obtained under green, red, and yellow light conditions. AC did not promote the diameter of pseudo -stem. Some Kaempferia plant lets were transferred to the greenhouse in different growing media composition. For 15 weeks, the plantlets could grow differently. K. rotunda was 3.55 cm in height when cultured in media composed of rice husk charcoal and coconut husk chips in ratio of 1:1, while the plants were only 1.95 in height in media consisted of pure loam. In week 20, underground part of plants could grow well in the former media in terms of fresh weight, sizes of underground stem, and sizes of storage roots. However, no underground storage parts were formed in Kaempferia code K-LP02 cultured in media consisted of loam and coconut coir in 1:1 ratio had 5.05 cm of leaf width and the underground plant parts had the highest fresh weight of 18.31 g. In addition, plants cultured in media consisted of pure rice husk had 10.36 cm of leaf length. Like the two previous kinds of Kaempferio, less in plant height. number of leaves were found in Koempferia code K-LP03 when plants were cultured in media consisted of pure loam. However, underground parts of plants reached 23.48 g of fresh weight when cultured media consisted of loam, peanut shells. and coconut coir in the ratio of 1:1:1. It was found that one kind of effective bacteria solution at certain concentration promoted growth of Koempferia rotunda in terms of height, number and size of leaves which were not different from those obtained when water was used. Moreover. two different kinds of effective bacteria solution did not promote growth of above and underground parts of Kaempferia code K-LP03. The study of genus Kaempferia using DNA barcode aims to identify 37 samples which include 12 species in genus Koempferia, K. albomaculata. K. angustifolia, K. elegan, K. galango. K. grandifolia. K. marginata. K. minuto, K. palchra. K. pardi. K. parviflora. K. roscoeana and K. rotunda. The standard DNA regions in chloroplast were selected including 4 genes (matK, rpoB, rpoC1 and rbcL) and 2 intergenic spacers (psbA-triH and tmL) followed by the nucleotide sequencing. The Neighbor-Joining method together with Kimura 2-parameter were used for evolutionary analysis using MEGA (version 6) program. The result showed that 3 out of 6 standard DNA regions (matk, rpoB and psbA-tmH) can be used to identify 10 out of 12 species in the Genus Kaempferio |
