สืบค้นงานวิจัย
การแปรรูปทางชีวภาพกากไคตินให้เป็นไคโตโอลิโกแซคคาไรด์
Dietmar Haltrich - มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี
ชื่อเรื่อง: การแปรรูปทางชีวภาพกากไคตินให้เป็นไคโตโอลิโกแซคคาไรด์
ชื่อเรื่อง (EN): Bioconversion of Chitin wastes into Chitooligosaccharide
บทคัดย่อ: กระบวนการแปรรูปทางชีวภาพกากไคตินให้เป็นไคโตโอลิโกแซคคาไรด์ ได้ถูกพัฒนาขึ้นมาสำเร็จตามวัตถุประสงค์ของโครงการวิจัยนี้ โดยวิธีการแปรรูปที่มีประสิทธิภาพนั้น ทำได้โดยการใช้ chitosan (ไคตินที่ถูกกำจัดหมู่อะเซตทิลออก) เป็น substrate แล้วใช้เอนไซม์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมเข้าไปตัดย่อยให้เป็น chito-oligosaccharide ที่มีความยาว และโครงสร้างแตกต่างกัน หลายรูปแบบ งานวิจัยแบ่งออกเป็น ๓ ส่วนหลัก ส่วนแรกคือการ ผลิตเอนไซม์ที่สามารถย่อย chitosan ได้อย่างมีประสิทธิภาพ นั่นคือ เอนไซม์ ไคโตซาเนส (chitosanase) จากเชื้อ แบคทีเรีย Bacillus subtilis สายพันธุ์ 168 โดยได้ทำการ clone ยีน แล้วนำไปผลิตในเชื้อ E. coli ตามแนวทางที่ได้พัฒนาขึ้นมาในห้องปฏิบัติการก่อนหน้านี้แล้ว จากนั้นได้ทำการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ พบว่ามีคุณสมบัติเหมาะสมในการที่จะปรับใช้ในการสังเคราะห์ COS ในระดับอุตสาหกรรมได้ เพราะ มีค่าความสามารถในการทำงาน (specific activity) สูง และ สามารถทำงานได้ในสภาวะที่มีค่าความเป็นกรดด่างที่กว้าง อีกทั้งในสภาวะที่เอนไซม์อยู่รวมกับสารตั้งต้น (substrate) คือไคโตซานนั้น พบว่าจะสามารถทนความร้อนได้สูงกว่าในสภาวะที่ไม่มี substrate ได้ถึง 100 เท่า โดยมีค่าครึ่งชีวิตของกิจกรรมเอนไซม์ (half-life) เท่ากับ 20 ชั่วโมง ที่อุณภูมิ 50 องศาเซลเซียส ที่ค่าความเป็นกรดด่าง 5.5 โดยความสามารถในการย่อยสลาย chitosan ให้เป็น COS อย่างมีประสิทธิภาพนั้น สามารถประเมินได้ ด้วยวิธีการ แยกผ่านแผ่น TLC ในส่วนที่ ๒ เป็นการศึกษาผลของ signal peptide ต่อการนำส่งเอนไซม์ chitosanase ออกจากเซลล์ E. coli ซึ่งผู้วิจัยได้ทำการตัดต่อยีนของเอนไซม์ ให้เชื่อมกับเปบไทด์นำส่ง (signal peptide) ที่มีประสิทธิภาพ ๒ ชนิด ผลจากการศึกษาพบว่า เส้นเปบไทด์ OmpA ซึ่งเป็นของ E. coli นั้น มีประสิทธิภาพดีที่สุด เพราะสามารถทำให้ผลิต และหลั่งเอนไซม์ออกมานอกเซลล์ ได้ในปริมาณสูง และเอนไซม์ยังสามารถทำหน้าที่ได้ดี เท่ากับเอนไซม์จากธรรมชาติ แต่อย่างไรก็ตาม พบว่าความสามารถของเซลล์ในการตัด เปบไทด์นำส่งทิ้ง เมื่อเอนไซม์เคลื่อนออกนอกเซลล์แล้ว มีความปรวนแปร ทำให้ได้เอนไซม์ที่มีปลายส่วนอะมิโน (N-terminal) แตกต่างกัน (heterogeneous) แต่เมื่อใช้เปบไทด์นำส่งของ Bacillus เอง แม้จะผลิตได้และส่งออกมาได้น้อยกว่า แต่ขบวนการตัดเอนไซม์นำส่งมีความแม่นยำกว่า ทำให้เอนไซม์ที่หลั่งออกมามีลักษณะเหมือนกันหมด ในส่วนที่ ๓ ซึ่เป็นส่วนสุดท้ายของโครงการวิจัยนี้ เป็นการวิเคราะห์โครงสร้าง COS ที่ผลิตได้ในเชิงลึก ด้วยการใช้เทคโนโลยีขั้นสูง ได้แก่ วิธี size exclusion chromatography (SEC), 1H-Nuclear Magetic Resonace (NMR) analysis และ Mass spectrometry ผลการวิเคราะห์พบว่า เอนไซม์ chitosanase BsCsn46A ที่พัฒนาขึ้นมาในโครงการนี้ สามารถตัดย่อย chitosan ที่มีค่า degree of acetylation หรือจำนวนกลุ่ม อะเซททิล ต่างๆ กัน ได้อย่างรวดเร็ว ด้วยระบบการตัดแบบ endo-mode โดยผู้วิจัยสามารถกำหนด คุณสมบัติของผลิตภัณฑ์ COS ที่ต้องการผลิตขึ้นได้ ด้วยการปรับ ชนิดของ chitosan ที่ใช้ (คือมีค่า degree of acetylation ที่แตกต่างกัน) และระยะเวลาในการให้เอนไซม์เข้าทำปฏิกริยา ผลการศึกษาในเชิงลึก ยืนยันผลการวิเคราะห์อย่างคร่าวๆ ด้วยวิธีการ TLC ในงานวิจัยที่ได้ทำมาก่อนหน้านี้แล้วว่า เอนไซม์ BsCsn46A จากโครงการวิจัยนี้ จะทำงานได้ดีในการตัดย่อย subsrate ที่ได้รับการกำจัดกลุ่ม acetyl ออกแล้ว เหมือนเอนไซม์ chitosanase อื่นๆ แต่เอนไซม์ จากโครงการวิจัยนี้ มีคุณสมบัติที่โดดเด่น ต่างจากเอนไซม์อื่นที่ได้เคยมีการรายงานมาก่อนหน้านี้แล้ว คือ เป็นเอนไซม์ที่มีความเร็วในการเข้าทำปฏิกริยาสูงที่สุดตั้งแต่เคยมีรายงานมา นอกจากนั้นแล้วผู้วิจัยยังได้ศึกษากลไกเชิงลึกในการเข้าทำปฏิกริยาของเอนไซม์ในแบบ endo-mode ด้วยการใช้น้ำโมเลกุลหนัก H218O ซึ่งพบว่า เมื่อใช้ substrate ที่มีความยาว 6 หน่วย (hexamer) นั้น เอนไซม์จะเข้าทำปฏิกริยา ได้ 3 รูปแบบ ในอัตรส่วนเท่าๆ กัน ที่ตำแหน่ง -4 - +2, -3 - +3 or -2 และ +4 ของ substrate ทั้งนี้องค์ความรู้ส่วนนี้ เป็นองค์ความรู้ในเชิงวิทยาศาสตร์บริสุทธิ์ ในด้านกลไกการทำงานของเอนไซม์ ผลที่ได้จากโครงการวิจัยนี้ได้รับการตีพิมพ์ในวารสารวิชาการระดับนานาชาติ ที่ต้องผ่านการประเมิน แล้ว ๒ เรื่อง และอยู่ในระหว่างเตรียมการพิมพ์อีก ๑ เรื่อง รวมทั้งได้ใช้เป็นส่วนหนึ่งของวิทยานิพนธ์ ของนักศึกษาในระดับปริญญา โท และเอก อย่างละ ๑ คน
บทคัดย่อ (EN): A process for the bioconversion of chitiwastes into chito-oligosaccharides (COS) has been successfully developed from this research project. The efficient bioconversion process was done by using chitosan (a deacetylated form of chitin) as a substrate for bioconversion by appropriate enzyme to generate various structures of COS. The research project is divided into 3 parts. In the first part, a GH46 chitosanase (CsnA) from Bacillus subtilis 168 was expressed in Escherichia coli by fusing the gene encoding mature Csn to the E. coli OmpA signal peptide sequence. The recombinant enzyme was secreted into the culture supernatant. The recombinant Csn showed high specific activity and stability over a wide range of pH. The enzyme was >100 times more thermostable in the presence of the substrate, with a half-life time of activity (tau(1/2)) of approximately 20 h at 50 degrees C and pH 5.5. Efficient bioconversion of chitosan into different mixtures of COS, using crude culture supernatant containing secreted enzyme was demonstrated by TLC. In the second part , Bacillus subtilis chitosanase (Csn) from this study was used as a model protein to compare the effect of two signal peptides on the secretion of heterologous recombinant protein. The results showed that the E. coli secretion machinery could recognize both native bacillus and E. coli signal peptides. However, only the native bacillus signal peptide could generate the same N-terminal sequence as in the wild type bacteria. When the recombinant Csn constructs contained the E. coli OmpA signal peptide, the secreted enzymes were heterogeneous, comprising a mixed population of secreted enzymes with different N-terminal sequences. Nevertheless, the E. coli OmpA signal peptide was found to be more efficient for high expression and secretion of bacillus Csn. For the last part, in-depth analysis of both the mode of action of the enzyme from this research project, and the composition of its products were studied. By using size exclusion chromatography (SEC), 1H- NMR, and mass spectrometry, it was shown that BsCsn46A can rapidly cleave chitosans with a wide-variety of acetylation degrees, using a non-processive endo-mode of action. The composition of the product mixtures can be tailored by varying the degree of actylation of the chitosan and the reaction time. As expected, the enzyme has a clear preference for cleaving after a deacetylated sugar, but detailed analysis of product profiles revealed differences compared to other chitosanases. Importantly, BsCsn46A seems to be one of the fastest chitosanases described so far. The endo-character of the enzyme was confirmed by a detailed analysis of preferred binding modes using H218O, which showed that a hexameric substrate has three productive binding modes occurring with similar frequencies, involving subsites -4 - +2, -3 - +3 or -2 to +4. The outcome of this research project led to two peer-review publications in international journals, and one manuscript in preparations for submission. In addition, this research project has been used as parts of one Ph.D. thesis and one Master thesis of graduate students of school of Biotechnology, SUT.
บทคัดย่อ: ไม่พบข้อมูลจากหน่วยงานต้นทาง
ภาษา (EN): th
เผยแพร่โดย: มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี
คำสำคัญ: กลูโคซามีน
เจ้าของลิขสิทธิ์: สำนักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ
หากไม่พบเอกสารฉบับเต็ม (Full Text) โปรดติดต่อหน่วยงานเจ้าของข้อมูล

การอ้างอิง

Dietmar Haltrich. "การแปรรูปทางชีวภาพกากไคตินให้เป็นไคโตโอลิโกแซคคาไรด์Bioconversion of Chitin wastes into Chitooligosaccharide". มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี. 2557

Dietmar Haltrich. "การแปรรูปทางชีวภาพกากไคตินให้เป็นไคโตโอลิโกแซคคาไรด์Bioconversion of Chitin wastes into Chitooligosaccharide". มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี. 2557. Print.



TARR Wordcloud:
การแปรรูปทางชีวภาพกากไคตินให้เป็นไคโตโอลิโกแซคคาไรด์
Dietmar Haltrich
มหาวิทยาลัยเทคโนโลยีสุรนารี
30 กันยายน 2557
การศึกษาผลของไคตินต่อการเจริญเติบโตและผลผลิตของงาดำ การผลิตไคตินจากไวรัสคลอเรลล่า การศึกษาสมบัติของคอมพอสิตโฟม ที่มีแป้งมันสำปะหลังไคติน อนุพันธ์ไคตินและน้ำยางพาราเป็นส่วนประกอบ การประยุกต์ใช้ไคโตโอลิโกแซคคาไรด์เป็นวัตถุกันเสียจากธรรมชาติในผลิตภัณฑ์ลูกชิ้นหมู การใช้ประโยชน์จากปูที่เหลือทิ้งจากอวนจมปูในการผลิตไคตินและไคโตซาน การกระตุ้นความต้านทานโรคพืชผักด้วยมูลและสารประกอบไคตินของไหมอีรี่ ปุ๋ยอินทรีย์ชีวภาพ ประสิทธิผลของสารชีวภาพไคตินในการเพิ่มพูนคุณภาพดินและจุลินทรีย์ดินเพื่อยับยั้งการเกิดโรคเหี่ยวเหลืองของมะเขือเทศ การประยุกต์ใช้ไคติน ไดอะตอมไมท์ และโดโลไมท์ในการเพิ่มผลผลิตของคะน้าพันธุ์ยอด การประยุกต์ใช้ไคโตโอลิโกแซคคาไรด์ร่วมกับเอนไซม์ทรานกลูตามิเนสในผลิตภัณฑ์ไส้แฮมเบอร์เกอร์ไก่พร้อมปรุงที่ผลิตจากเนื้อไก่แยกกระดูกด้วยเครื่อง
คัดลอก URL
กระทู้ของฉัน
ผลการสืบค้นทั้งหมด โพสต์     เรียงลำดับจาก
พัฒนาระบบโดยศูนย์ความรู้เฉพาะด้านวิศวกรรมความรู้และวิศวกรรมภาษาDeveloped by Center of Excellence for Unified Knowledge and Language Engineering
สนับสนุนโดยสำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน)Supported by the Agricultural Research Development Agency (Public Organization)
แบบสำรวจความพึงพอใจQuestionair